徐濤，董柯夢，王彤，王文嬌，李慧，石翠格，楊予濤，徐志卿，4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京神經(jīng)修復(fù)與再生重點實驗室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，北京 100069；3.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；4.首都醫(yī)科大學(xué)北京腦重大疾病研究院，科技部北京腦重大疾病重點實驗室，北京 100069)

臨床研究表明，孕期應(yīng)激母親所生新生兒易出現(xiàn)出生體重低及運(yùn)動能力差等情況[1-2]，且其童年可表現(xiàn)出抑郁、焦慮以及認(rèn)知障礙等[3-4]。動物實驗研究表明孕期應(yīng)激可延長大鼠的懷孕周期[5]、降低新生鼠成活率和雄鼠出生體重[6]、增加子代大鼠青少年時期[7-8]或成年時期的抑郁樣行為[9-14]。因此，母體孕期環(huán)境對子代腦發(fā)育及成年后神經(jīng)行為具有重大影響。本研究采用大鼠孕期束縛模型，觀察子代出生體重和性別比，選擇與認(rèn)知和情緒性疾病高度相關(guān)的兩個腦區(qū)：前額葉皮層(PFC)和海馬，研究子代PFC和海馬甘丙肽(GAL)、甘丙肽受體(GALRs)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和酪氨酸激酶B(TrkB)的表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上探討孕期應(yīng)激致子代腦發(fā)育異常的性別差異，進(jìn)而為今后臨床胎兒和新生兒腦發(fā)育障礙的早期干預(yù)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實驗動物和分組

6只成年雄性SD大鼠(180～200 g)，12只成年雌性SD大鼠(160～180 g)，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[許可證號：SCXK(京)2016-0011]。實驗用SD大鼠領(lǐng)取后，先雌雄分開(3只一籠)飼養(yǎng)3 d，使大鼠適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境。動物飼養(yǎng)房室溫保持在(23±1)℃，濕度維持在(50±5)%，12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。3 d后雌雄SD大鼠合籠(兩雌一雄)，每日早晨8點觀察有無陰道栓。以見栓日作為懷孕第1天，即孕1 d。懷孕大鼠3只一籠分開飼養(yǎng)，并隨機(jī)分為對照組及孕期應(yīng)激組(每組各6只)。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批通過。

二、實驗方法

1. 孕期應(yīng)激大鼠模型：孕期應(yīng)激組雌鼠孕8 d至孕21 d，每日同一時間段內(nèi)給予孕期應(yīng)激組大鼠束縛應(yīng)激2 h，1次/d。束縛后放回籠內(nèi)。待臨近生產(chǎn)時將全部孕期應(yīng)激組孕鼠單籠飼養(yǎng)。對照組孕鼠常規(guī)飼養(yǎng)不做任何處理，待臨近生產(chǎn)時單籠飼養(yǎng)。SD大鼠分娩日(記為子代P0 d)記錄產(chǎn)仔數(shù)，計算雌雄比例并稱量子代體重。孕鼠產(chǎn)后1周后依次進(jìn)行糖水偏好實驗、曠場實驗和強(qiáng)迫游泳實驗。為防止個體誤差，入組子代來自不同的母鼠。

2. 糖水偏好實驗：實驗前3 d開始對大鼠進(jìn)行糖水預(yù)適應(yīng)。將1%蔗糖水及清水置于大鼠籠上，每12 h交換位置，使大鼠適應(yīng)糖水味道。實驗前對大鼠禁水12 h。實驗時將大鼠單獨置于干凈的籠內(nèi)，不放置任何食物。將事先稱重的干燥糖水瓶及干燥清水瓶置于籠上，大鼠在安靜無打擾的環(huán)境中自由飲水1 h。實驗結(jié)束后對糖水瓶及清水瓶稱重，計算每只大鼠的糖水消耗率[糖水飲用量/(糖水飲用量+清水飲用量)×100%]。

3. 曠場實驗：將大鼠置于底壁黑色的曠場箱中央格內(nèi)(150 cm×150 cm×60 cm)，曠場箱被平均分為25個同樣大小的方格。大鼠可自由在曠場箱內(nèi)探索5 min。采用雙盲法記錄其間大鼠水平穿格次數(shù)及直立次數(shù)。

4. 強(qiáng)迫游泳實驗：將大鼠置于玻璃缸(高70 cm，直徑40 cm)中，水深約40 cm，水溫(25±2)℃。每次實驗持續(xù)5 min。實驗過程由攝像機(jī)記錄，之后經(jīng)雙盲法計算每只大鼠的攀爬時間(劇烈的運(yùn)動伴隨前爪不斷的進(jìn)出水面，身體常常豎直貼靠側(cè)壁)及不動時間(大鼠停止掙扎僅漂浮在水中或僅有必要的輕微動作以保持頭部在水面以上)。

5. 大鼠腦組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：按窩別隨機(jī)取P0 d雌雄子鼠各6只，剝離整腦后，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜迅速分離PFC、海馬，并置于干冰預(yù)冷的EP管中。應(yīng)用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒(QIAGEN，德國)提取腦組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(Nano Drop 2000)測定樣品RNA濃度及OD260/OD280比值。應(yīng)用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(ROCHE，瑞士)將1 μg腦組織中提取的總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。

6. 實時定量PCR(Q-PCR)：應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄成的cDNA及SYBR Green試劑(Life Technologies，美國)進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)。Q-PCR體系分為8 μl，循環(huán)條件為：60℃ 2 min，95℃ 10 min，40個循環(huán)中包括95℃變性15 s，60℃延伸1 min。結(jié)果運(yùn)用2-ΔΔCt相對Q-PCR分析方法進(jìn)行分析。Q-PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、孕期束縛應(yīng)激對SD大鼠抑郁樣行為的影響

孕鼠產(chǎn)后1周后開始檢測產(chǎn)后大鼠的抑郁樣行為，包括糖水偏好實驗、曠場實驗以及強(qiáng)迫游泳實驗。在抑郁樣行為判定的金標(biāo)準(zhǔn)糖水偏好實驗中，孕期束縛組大鼠的糖水消耗率較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1A)。在曠場實驗中，兩組大鼠的水平運(yùn)動得分及垂直運(yùn)動得分均無顯著性差異(P0.05)(圖1B、C)。在強(qiáng)迫游泳實驗中，孕期應(yīng)激組大鼠的不動時間顯著延長，而攀爬時間顯著縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1D、E)。

二、孕期束縛應(yīng)激對SD大鼠新生子代體重的影響

孕期應(yīng)激組和對照組的子代大鼠在出生日測量體重結(jié)果顯示，孕期應(yīng)激組P0 d的體重較對照組的子代大鼠體重顯著減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

三、孕期束縛應(yīng)激對SD大鼠產(chǎn)仔數(shù)及子代雌雄比的影響

兩組大鼠產(chǎn)仔數(shù)和子代出生日性別比結(jié)果顯示，孕期應(yīng)激組大鼠平均產(chǎn)仔數(shù)及子代雌雄比有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(表3)。

A：兩組大鼠糖水偏好實驗糖水消耗率比較；B：兩組大鼠曠場實驗水平運(yùn)動得分比較；C：兩組大鼠曠場實驗垂直運(yùn)動得分比較；D：兩組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗不動時間比較；E：兩組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗攀爬時間比較。Cont：對照組；PS：孕期應(yīng)激組。與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001圖1 兩組大鼠抑郁樣行為的檢測結(jié)果

組 別子代鼠數(shù)量體重(g)對照組 667.57±0.23孕期應(yīng)激組776.45±0.19**

注：與對照組比較，**P<0.01

表3 兩組大鼠平均產(chǎn)仔數(shù)和子鼠出生性別比(-±s)

四、孕期束縛應(yīng)激對子代新生鼠腦組織中GAL、GALRs、BDNF、TrkB在PFC的表達(dá)影響

統(tǒng)計分析表明，孕期應(yīng)激組子代雌性大鼠P0 d PFC中的GALR1 mRNA及BDNF mRNA表達(dá)水平較對照組顯著降低[分別為(0.51±0.13)vs.(1.04±0.11)、(0.73±0.07)vs.(1.11±0.10)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雄性大鼠相應(yīng)基因表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖2B、E)。孕期應(yīng)激組子代雄性大鼠P0 d PFC中的TrkB mRNA表達(dá)水平較對照組顯著升高[(1.35±0.12)vs.(1.00±0.07)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雌性大鼠相應(yīng)基因表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖2F)。孕期應(yīng)激組子代雌、雄性大鼠P0 d PFC中GAL mRNA、GALR2 mRNA、GALR3 mRNA表達(dá)水平與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖2A、C、D)。

五、孕期束縛應(yīng)激對子代GAL、GALRs、BDNF、TrkB在海馬中表達(dá)的影響

統(tǒng)計分析表明，孕期應(yīng)激組子代雌性大鼠P0 d海馬中的GAL mRNA表達(dá)水平較對照組顯著升高[(2.51±0.18)vs.(1.00±0.11)]，BDNF mRNA表達(dá)水平較對照組顯著降低[(0.75±0.05)vs.(1.00±0.03)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；雄性大鼠相應(yīng)基因表達(dá)水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖3A、E)。孕期應(yīng)激組子代雌、雄性大鼠P0 d海馬中的GALR1 mRNA、GALR2 mRNA、GALR3 mRNA及TrkB mRNA表達(dá)水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖3B～D、F)。

對照組;孕期對照組A：GAL mRNA的相對表達(dá)量比較；B：GALR1 mRNA的相對表達(dá)量比較；C：GALR2 mRNA的相對表達(dá)量比較；D：GALR3 mRNA的相對表達(dá)量比較；E：BDNF mRNA的相對表達(dá)量比較；F：TrkB mRNA的相對表達(dá)量比較。與對照組比較，*P<0.05圖2 兩組子代大鼠PFC腦區(qū)GAL、GALRs、BDNF、TrkB mRNA表達(dá)結(jié)果

對照組;孕期對照組A：GAL mRNA的相對表達(dá)量比較；B：GALR1 mRNA的相對表達(dá)量比較；C：GALR2 mRNA的相對表達(dá)量比較；D：GALR3 mRNA的相對表達(dá)量比較；E：BDNF mRNA的相對表達(dá)量比較；F：TrkB mRNA的相對表達(dá)量比較。與對照組比較，**P<0.01；***P<0.001圖3 兩組子代大鼠海馬腦區(qū)GAL、GALRs、BDNF、TrkB mRNA表達(dá)結(jié)果

討 論

孕婦抑郁癥患者的神經(jīng)內(nèi)分泌改變可直接造成胎兒腦發(fā)育異常，造成成年后一系列神經(jīng)行為障礙[15]。本研究通過抑郁行為學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)孕期應(yīng)激組母鼠糖水偏好率、強(qiáng)迫游泳時間和不動時間較對照組均有顯著差異(P<0.05)，說明本研究中的孕鼠具有明確的抑郁行為，為我們研究子代腦發(fā)育提供了良好的病理模型。

在母鼠孕期應(yīng)激過程中，可導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素增高，從而影響蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而導(dǎo)致儲備不足，這將破壞胎盤和胎兒的正常構(gòu)建。本實驗中，孕期應(yīng)激組子代體重較對照組顯著性降低(P<0.05)，且其子代的雌雄比較對照組有增高的趨勢。以上結(jié)果提示孕期應(yīng)激影響了子代的發(fā)育過程。

PFC和海馬是與應(yīng)激和情緒性疾病高度相關(guān)的腦區(qū)[16-17]。在海馬腦區(qū)：孕期應(yīng)激組雌性子代鼠GAL mRNA表達(dá)水平較對照組顯著增高，BDNF mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)；在雄性子代鼠，孕期應(yīng)激組與對照組幾項指標(biāo)比較均無顯著性差異(P0.05)。相關(guān)電生理實驗表明GAL能夠抑制海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞的興奮性突觸后電位，抑制海馬腦區(qū)興奮性氨基酸的釋放[18]。BDNF mRNA的表達(dá)降低也提示該腦區(qū)可能存在突觸可塑性降低，且GAL和BDNF可能發(fā)生了協(xié)同作用。因而，子代雌鼠腦區(qū)變化，可能在一定程度上降低了細(xì)胞的興奮性。在PFC，雌性子代鼠GALR1和BDNF mRNA的表達(dá)顯著下降，而雄鼠TrkB mRNA表達(dá)較對照顯著增加(P<0.05)。GALR1主要通過激活Gi/o介導(dǎo)抑制功能，GAL在藍(lán)斑中與去甲腎上腺素共存[19]；在中縫背核中與五羥色胺(5-HT)共存[20-21]。PFC是藍(lán)斑和中縫背核主要的上行投射區(qū)之一，因此雌性子代大鼠有可能成年后發(fā)生抑郁行為，雄性子代大鼠TrkB mRNA表達(dá)增加可能發(fā)揮代償性的保護(hù)作用。關(guān)于孕期應(yīng)激引起的子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的形態(tài)學(xué)和遠(yuǎn)期行為學(xué)改變，后期我們將繼續(xù)關(guān)注并進(jìn)行深入探討。

綜上所述，大鼠孕期應(yīng)激可對子代大鼠腦發(fā)育產(chǎn)生影響，且對雌性子代的影響較雄性子代更大，具有性別差異。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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