王 昱

(隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術學院 隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500)

在肝臟相關代謝類疾病中，脂肪肝是危害人類健康的第二大肝病，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是遺傳、環(huán)境、代謝應激相關性疾病，現(xiàn)已成為世界慢性肝病的重要病因，可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌和移植肝復發(fā)等特點，但確切發(fā)病機制目前仍不清楚[1，2].多酚、黃酮及橄欖苦苷是油橄欖葉主要活性成分.已有大量研究證實，油橄欖葉提取物在排鉛、海洛因脫毒、預防糖尿病、抗衰老、減輕缺血再灌注損傷等方面表現(xiàn)出突出的效果[3-12]，具有調節(jié)肝臟抗氧化能力、改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠肝功能的作用[13].為進一步闡明其作用機制，本研究擬以小鼠為實驗材料建立非酒精性脂肪肝動物模型，探討肝細胞脂肪酸β氧化的調控因子，觀察油橄欖葉提取物(olive leaf extract，OLE)對NAFLD的影響，以揭示OLE防治NAFLD的作用機制.

1 材料與方法

1.1 材料

油橄欖葉提取物(隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司)；兔抗CPT-1抗體、免疫組織化學試劑盒和DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑、定量PCR試劑(Taka Ra公司)，PCR引物由上海涵悅生物科技有限公司設計，上海生工生物技術有限公司合成.

高速臺式冷凍離心機(Beckman美國TGL-16M)等；7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀(美國ABI)；核酸蛋白分析儀(美國貝克曼庫爾特公司).40只清潔級昆明小鼠(購于蘭州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(甘)2009-0004)，體質量18～20 g，雌雄各半.

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與給藥

健康昆明小鼠40只，隨機分為4組，即正常組、模型組、OLE低劑量組(I)、OLE中劑量組(II)和OLE高劑量組(III)，每組10只.參照文獻[14]，正常組普通飼料喂養(yǎng)，其他各組每天給高脂飼料(繁殖鼠料54.8%，18.9%豬油，1.3%膽固醇，0.3%膽鹽，11.2%蔗糖，8.7%酪蛋白，1.8%預混料及3%麥芽糊精)喂養(yǎng)9周，從造模第2周起正常組和模型組灌胃0.1 mL/10g·d-1生理鹽水，I、II、III治療組分別灌胃250、500、1 000 mg/kg OLE，每日1次，連續(xù)給藥8周.

1.2.2 PCR檢測肝組織CPT-1 mRNA 的表達

取小鼠肝臟，放入2 mL 的離心管，加入1 mL Trizol后用勻漿器反復研磨，離心(14 000 r / min)10 min，取上清液通過酚-氯仿抽提RNA.將抽提的RNA 進行逆轉錄反應，實時熒光PCR擴增.PCR按照試劑盒說明書進行操作，25 μL 反應體系.反應條件： 預變性 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；40個循環(huán)中 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s.計算目的產(chǎn)物CPT-1 mRNA 和內參照 β-actin 灰度值的比值( CT 值) 來反映其相對含量.取 3 次重復實驗結果的均值進行比較，引物序列見表1.

表1目的基因引物序列

1.2.3 免疫組織化學

免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法).末次給藥后，取大鼠肝臟數(shù)塊置于4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后冠狀位切片，厚6 μm.脫蠟、抗原修復后，用3% H2O2室溫孵育10 min，正常兔血清室溫封閉30 min，然后用兔抗鼠CPT-1多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜.次日取出切片以PBS沖洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG孵育30 min，SABC工作液孵育30 min.最后DAB顯色，蘇木素復染，空白對照以PBS代替一抗.常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.4 圖像分析

用美國Image-proplus 5.0 專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析.從CPT-1陽性反應的切片中各選3 張，檢測活性物質在肝臟中表達的強度.測量時保證光源的穩(wěn)定，并且取圖之前預熱20 min以上.采圖時各項設置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光強度、敏感度、對比度等均改為手動調節(jié)且固定，以保證每次取圖系統(tǒng)的設置值一樣.取平均光密度和積分光密度兩個指標，測量值的平均值為最終灰度值.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 OLE對NAFLD 小鼠肝組織CPT-1 mRNA表達的影響

由圖1可知，模型組小鼠肝組織CPT-1 mRNA表達量較正常組顯著降低(P<0.01)；I、II、III治療組小鼠肝組織CPT-1 mRNA表達量較模型組顯著升高(P<0.05，P<0.01).

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05).下同.

圖1 OLE對NAFLD小鼠肝組織CPT-1 mRNA表達的作用

2.2 OLE對小鼠肝臟CPT-1蛋白表達的影響

免疫組織化學顯示：CPT-1蛋白在各實驗組小鼠肝臟中都有不同程度的陽性表達.陽性表達部位被染成棕黃色，陰性對照組無CPT-1蛋白陽性表達(圖2).與正常組相比，模型組小鼠肝臟CPT-1蛋白的表達水平減弱、陽性細胞數(shù)減少(P<0.01).各給藥組與模型組比較，小鼠肝臟CPT-1蛋白的表達增強、陽性細胞數(shù)增加(P<0.05，P<0.01，圖3).

圖3 各組小鼠肝臟CPT-1蛋白表達的比較

3 討論

NAFLD是一種遺傳-環(huán)境-代謝應激相關性疾病，發(fā)病原因目前尚不能以單一的機制解釋，比如西方學者提出的“二次打擊”學說，中醫(yī)認為“痰凝血瘀”、“ 陽氣不通”是NAFLD的關鍵病機[15].中藥具有活性成分多、作用靶點多、給藥途徑多、不良反應小等特點，顯示出良好的臨床療效和安全性.油橄欖葉主要活性成分是多酚、黃酮及橄欖苦苷.前期實驗已證實，油橄欖葉提取物具有抗氧化損傷、減少炎癥因子分泌、調節(jié)血脂的藥效學效應[13].因此，本實驗選用OLE進一步探討其對肝細胞脂質變性的防治作用和可能機制.

肉毒堿棕櫚?；D移酶(carnitine palmitoyltransferase，CPT)分為CPT-1和CPT-2兩類.CPT1是脂肪酸β氧化過程中的限速酶，位于線粒體外膜，是脂肪酸進入線粒體流量的關鍵調控位點，催化長鏈脂肪酸從?；o酶A轉移到肉毒堿上，進而從胞漿進入線粒體內部，并且進一步在位于線粒體內膜上的CPT-2催化下進行β氧化，在轉運脂肪酸通過線粒體內膜的過程中起重要作用[16].CPT-1 mRNA 表達水平的明顯下降可導致脂肪酸活化產(chǎn)物脂酰輔酶A向線粒體內轉運減少，使已進入細胞的脂肪酸及其活化產(chǎn)物脂酰輔酶 A 沉積在胞漿內，從而加劇細胞內大量脂質堆積[17，18].本實驗結果顯示，模型組小鼠肝組織CPT-1表達水平明顯降低，經(jīng)OLE干預后，肝組織CPT-1表達水平均呈上升趨勢.表明OLE 對其有上調作用.研究[19，20]表明，降低CPT-1在肝臟中的表達，能調節(jié)血脂水平，提示活化CPT-1調控線粒體代謝可能是OLE發(fā)揮改善脂質代謝紊亂分子機制.

綜上所述，OLE能夠減輕NAFLD小鼠肝細胞內脂肪沉積，提高CPT-1 的表達水平，調節(jié)脂肪酸β氧化.CPT-1作為脂肪酸代謝過程中的關鍵酶，對脂肪肝的發(fā)生發(fā)展起著重要作用.而以CPT-1為靶點進行脂肪肝治療的化學藥物開發(fā)較少.同時，發(fā)現(xiàn)并明確機理的天然物質也幾乎沒有.該實驗為研發(fā)OLE制劑防治肝損傷相關疾病提供了理論與實驗依據(jù)，因此具有良好的開發(fā)前景.

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