胡 紅，雒曉芳，龍子揚，熊 梅，唐陽國，王福彬

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州 730030)

多環(huán)芳烴化合物(PolycyclicAromaticHydrocarbons，PAHs)是烴源巖、原油、煤以及現(xiàn)代沉積物中含量僅次于飽和烴的重有機族組分，它由很多化合物組成[1].芴(Fluorene)屬于一種多環(huán)芳烴，常存在于石油、煤焦油及煙草等物質(zhì)中.這些物質(zhì)燃燒或者處理不徹底就會將芴排入環(huán)境，如煙草燃燒、燃煤、汽車排氣[2]，在地表水以及土壤中也能檢出芴[3-5].在石油中，芴的含量表現(xiàn)出較高比重[1]，因此在石油污染的地方芴含量也較高.

芴對眼睛、皮膚及呼吸道會產(chǎn)生剌激，食入后可引起惡心、嘔吐及腹瀉[6]，對人體健康及生態(tài)環(huán)境具有一定的風險，是一種值得引起重視的環(huán)境污染物，因此對芴進行降解也應(yīng)予以重視.

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)比較活躍的組分，在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定以及受損生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建過程中發(fā)揮重要作用[7].有些土壤微生物類群能通過基因表達的蛋白酶，或通過共代謝作用降解有機污染物[8].有的類群形成了以某些污染物作為惟一碳源或能源的生理代謝特征.向林[9]等人對水中芴的微生物降解途徑進行研究并取得較明顯的成果.

由陜西濟源油田附近被石油污染的土壤中分離純化得到的X2菌株，用于芴的降解效果，具有科學性及實踐性.本實驗首次以X2菌株對芴進行降解，以探究該菌對生物環(huán)境治理的意義，為進一步發(fā)現(xiàn)新的石油污染治理提供思路.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離材料

該菌株來源于西北民族大學實驗中心形態(tài)實驗室，由陜西濟源油田附近土壤中分離獲得，初步命名為X2.

1.1.2 培養(yǎng)基

1) 種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂12 g/L.

2) 發(fā)酵培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉3 g/L，NaCl 5 g/L.

1.1.3 試劑

鹽酸(AR)；濃硫酸(AR)；氫氧化鈉(AR)；芴(AR)；環(huán)己烷(AR)；活性炭(AR)等.

1.1.4 儀器

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，Q/BKYY22-2001型凈化工作臺(上海躍進醫(yī)療器械廠)，TDL-50B臺式離心機，HH-B11-600-BS-Ⅱ型電熱培養(yǎng)箱，BCD-235型Haier冰箱(青島海爾股份有限公司)，氣流烘干箱，F(xiàn)A2204N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)，Mb型數(shù)顯恒溫電熱板，DHG-9140A型 新型電熱恒溫鼓風干燥箱，ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器，HVE-50高壓滅菌鍋Hirayama manufacturing corporation made in Japan，UV-2300紫外分光光度計，雙光束紫外可見分光光度計以及常見的玻璃儀器.

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

取4 ℃冰箱保存的X2菌株接種于種子培養(yǎng)基中活化，然后再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中擴大，經(jīng)28 ℃恒溫振蕩72 h[10，11]，然后放置4 ℃冰箱保存待用.全程應(yīng)采取無菌操作技術(shù)，防止其他雜菌污染.

1.2.2 菌株對各物質(zhì)在不同條件下的降解1.2.2.1 不同溫度下的降解率

將5 mL(菌濃度為0.80～1.41×108個/mL)的菌液分別加入處理好的含有0.3 g芴的三角瓶中，設(shè)置溫度單因素分別為25 ℃、27 ℃、30 ℃、34 ℃.分別在設(shè)置的溫度下，于恒溫振蕩箱中培養(yǎng)72 h后，測定培養(yǎng)物的吸光度，記錄、制圖并且計算[12].

1.2.2.2 不同pH值下的降解率

用0.5 mol/L的鹽酸和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)5 mL(菌濃度為0.80～1.41×108個/mL)菌液的pH值.設(shè)置pH值單因素分別為6.0、7.0、8.0、9.0[2]，然后加入到含0.3 g芴的三角瓶中，在恒溫振蕩箱中培養(yǎng)72 h后，測定培養(yǎng)物的吸光度，記錄、制圖并且計算.

1.2.2.3 不同芴的質(zhì)量下的降解率

將5 mL(菌濃度為0.80～1.41×108個/mL)的菌液加入處理好的含有芴的三角瓶中，設(shè)置芴的質(zhì)量單因素分別為0.3 g，0.6 g，0.9 g，1.2 g，在恒溫振蕩箱中培養(yǎng)72 h后，測定培養(yǎng)物的吸光度，記錄、制圖并且計算.

1.2.2.4 不同鼠李糖脂濃度下的降解率

將5 mL(菌濃度為0.80～1.41×108個/mL)菌液加入到含有0.3g芴的三角瓶中，設(shè)置鼠李糖脂濃度單因素為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、500 mg/L，在恒溫振蕩箱中培養(yǎng)72 h后，測定培養(yǎng)物的吸光度，記錄、制圖并且計算.

1.2.3 多因素交互試驗

利用Design-Expert8.0.6軟件中Box-BehnkenDesign模型，將單因素試驗結(jié)果用來設(shè)計多因素交互方案，并按照所設(shè)計方案進行模型試驗及驗證試驗，因素水平編碼表如表1所示.

表1芴降解響應(yīng)面試驗因素及水平

2 結(jié)果

2.1 不同芴質(zhì)量降解率的影響

芴的質(zhì)量對降解率的影響結(jié)果見圖1.

圖1 不同質(zhì)量梯度下芴的降解率

由圖1可以看出，芴的降解率在0.3～1.2 g之間，降解率先緩慢增大后再大幅減小，在0.6 g時降解率達到最大.在0.6 g以前降解率維持在較高水平，起伏較小，都在80%以上.可見芴的質(zhì)量較小時更適合X2的降解作用；而質(zhì)量在0.6 g后，曲線走勢陡峭呈明顯下降趨勢，降解率也隨之下降.降解率最大達82.2%，最低至45.2%，降解率極差達37.0%.可見芴的質(zhì)量對其降解率有較大影響.

2.2 溫度對各物質(zhì)降解率的影響

溫度對芴降解率的影響結(jié)果見圖2.

圖2 不同溫度下芴的降解率

由圖2可以看出，不同溫度對芴的降解影響有著較為明顯的差異，曲線呈明顯的“拋物線”形狀，降解率起伏較為明顯.溫度在25～34 ℃間，芴的降解率先增加后減小，28 ℃左右時到達峰值.25～28 ℃時降解率增大較快，在28～30 ℃之間降解率都維持在70%左右.28～34 ℃區(qū)間內(nèi)降解率呈下降趨勢，但走勢較為平緩.降解率最大達73.6%，最低至47.9%，極差達25.7%.可見該菌不耐熱，即菌株處于該溫度條件時生長最旺盛，與諸多文獻描述該菌的最適生長溫度一致[11，12].

2.3 pH值對各物質(zhì)降解率的影響

pH值對芴降解率的影響結(jié)果見圖3.

圖3 不同pH值條件下芴的降解率

由圖3可以看出，pH值對各芴的降解效果有較大差異.在pH值為6～9之間時芴降解率先快速增大后緩慢減小，到7左右時降解率達到最大.在6～7之間時降解率上升較快，從32.3%增加到53.0%，極差達20.7%.而pH值為7～9之間時下降十分緩慢，基本上維持在一個穩(wěn)定水平.可見對芴的降解在偏中堿性時更高，或者說更適合菌的生長.在酸性環(huán)境下該菌的生長、酶的活性受到抑制，從而使芴降解更困難，說明該菌不耐酸[11，12].整體上pH對芴的降解影響較大，最大降解率只能到達50%左右.

2.4 鼠李糖脂濃度對各物質(zhì)降解率的影響

鼠李糖脂濃度對芴降解率的影響結(jié)果見圖4.

圖4 不同鼠李糖脂濃度下芴的降解率

由圖4可以看出，鼠李糖脂作為表面活性劑對各物質(zhì)的降解效果較為明顯.鼠李糖脂濃度在100～500 mg/L范圍內(nèi)，芴的降解率先快速增大后緩慢減小.在100～200 mg/L之間時曲線呈上升趨勢，走勢陡峭，降解率從26.3%達到71.7%，極差達45.4%，變化十分顯著.濃度在300～500 mg/L之間時曲線為下降趨勢，且較為緩和，降解率下降不到10%.在鼠李糖脂濃度在200～300 mg/L時，對芴有較高降解率.

2.5 多因素交互設(shè)計

1) 以菌株X2對芴的降解率為響應(yīng)值R1，設(shè)計4因素3水平共29個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1，方差分析見表3.

表2芴響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果

表3 方差分析表

按照Design-Expert8.0.6軟件中Box-BehnkenDesign模型對試驗中芴的降解率進行回歸分析，得到回歸方程如下：

R1=0.84-0.043A-0.015B+0.024C+0.0097D-0.014AB-0.038AC-0.022AD-0.040BC-0.045BD-0.048CD-0.086A2-0.060B2-0.099C2-0.082D2.

式中A、B、C、D分別為表1表2所示的自變量編碼值；A： 芴的質(zhì)量/g，B：溫度，C：pH值，D：鼠李糖脂濃度，R1：芴的降解率.

由方差分析表可以得到以下分析：

模型檢驗結(jié)果顯示，F(xiàn)值為2.12(P值=0.0862>0.05)，模型擬合度不顯著，意味著模型存在8.62%的幾率為噪音.在該試驗中A2，B2，C2，D2，四個因素各自對F的降解率影響分別為顯著、不顯著、極顯著、顯著，對降解率影響力大小為C>A>D>B.模型失擬系數(shù)lackoffitF-value=3.6(lackoffitpro=0.1142>0.05)是不顯著的.由模型信噪比檢驗可知道，該模型Adeq精密度為5.888(Adeq精密度大于4是可取的)，即該模型可用于設(shè)計空間試驗.模型兩因素交互作用見圖5.

圖5 AB交互作用(左：等高線圖，右：3D圖)

圖6 AC交互作用(左：等高線圖，右：3D圖)

圖7 AD交互作用(左：等高線圖，右：3D圖)

圖8 BC交互作用(左：等高線圖，右：3D圖)

圖9 BD交互作用(左：等高線圖，右：3D圖)

圖10 CD交互作用(左：等高線圖，右：3D圖)

圖5、6、7、8、9、10分別顯示了AB、AC、AD、BC、BD、CD兩因素間的交互作用對芴的降解率影響，圖分為等高線圖和3D圖.等高線圖中顏色的變化代表降解率的變化，從而可以對二者的交互情況進行分析.處于同一橢圓上的點其響應(yīng)值R1(降解率)相同，等高線呈圓形表示兩因素之間交互作用不顯著，而等高線呈橢圓形表示兩因素之間交互作用顯著.3D圖則能更清楚地顯示響應(yīng)值的變化趨勢，因素對試驗結(jié)果影響越大3D曲面越陡峭[13，14].從圖中可對任意兩因素之間的交互影響的效應(yīng)進行分析和評價，從而確定最佳的因素水平范圍.模型的兩因素交互影響中AB，AC，AD，BC，BD，CD的交互作用對芴的降解率全都不顯著.從模型檢驗結(jié)果可以得出，兩因素交互作用對芴的降解率影響大小排序為CD>BD>BC>AC>AD>AB.

2.6 驗證實驗

該實驗研究了菌株X2對芴降解的4個單因素影響條件，得出該菌降解芴的較佳條件分別為，芴的質(zhì)量0.6 g左右(菌懸液5 mL，菌濃度為0.80～1.41×108個/mL)，溫度為28 ℃～29 ℃，pH值在7～8.鼠李糖脂濃度在200～300 mg/L時，該菌株對芴有較高的降解率，分別可達82.19%、74.23%、53.95%、71.70%.

利用Box-Behnken對4個單因素結(jié)果進行處理，得到了多因素交互設(shè)計方案，預(yù)測芴最佳降解條件為芴的質(zhì)量0.51 g、溫度28.62 ℃、pH值7.79，鼠李糖脂209.62 mg/L，預(yù)期降解率可達84.65%.驗證試驗3次后結(jié)果得到降解率為83.74±1.34%.對二者進行雙重比較發(fā)現(xiàn)差異性不顯著.

3 結(jié)論

從近幾年生物技術(shù)的發(fā)展來看，用生物手段來處理環(huán)境污染問題十分常見，并取得明顯的成果.如用微生物生物處理水中芴，當納米Fe-Ni雙金屬添加量為3 g/L、芴初始濃度為0.5 mg/L、溫度為30 ℃、pH為5的條件下，去除效果最好，去除率可達到96.2%[8].因此本試驗用一株菌來降解芴時具有科學性、合理性.試驗結(jié)果得到了X2菌降解芴的最佳配比方案，極大地提高了X2菌對芴的降解效果，為X2菌降解其他物質(zhì)、其他菌對芴的降解、芴的其他降解方案等作參考對比，為環(huán)境中污染物特別是多環(huán)芳烴類物質(zhì)的降解處理提供試驗思路.

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