韋柳娟 ，李 佳 ，熊廷楷，張?chǎng)┦猓顣?huì)敏，白仲林

(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

藜麥被稱(chēng)為丟失的遠(yuǎn)古“營(yíng)養(yǎng)黃金”，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and agriculture organization of the united nations簡(jiǎn)稱(chēng)：FAO)已將其列為可以滿(mǎn)足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的惟一一種單一植物.1980年，由美國(guó)兩位科學(xué)家“重新”發(fā)現(xiàn)了藜麥極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并帶回美國(guó)，使藜麥的有機(jī)成分被現(xiàn)代文明認(rèn)識(shí).這種遠(yuǎn)古植物漸漸走進(jìn)全球更多人家的餐桌[1-4].

傳統(tǒng)的測(cè)定氨基酸[5]方法有：按分離方法可分為氣相色譜法[6].離子交換法、反相高效液相色譜法[7]等.本實(shí)驗(yàn)采用中空纖維膜吸附萃取氣質(zhì)聯(lián)用的方法[8～9]，探究藜麥中氨基酸提取的較優(yōu)條件.本實(shí)驗(yàn)以PVDF聚偏氟乙烯中空纖維膜為主，以硅膠為填料，并對(duì)填料進(jìn)行了改性，探索不同因素下的最優(yōu)因素.實(shí)驗(yàn)用環(huán)糊精改性的硅膠做為填料，也是實(shí)驗(yàn)的一大創(chuàng)新之處.

1 材料和儀器

1.1 材料

藜麥：山西稼祺藜麥開(kāi)發(fā)有限公司(貨號(hào)：JQLM-004，產(chǎn)地：山西朔州).

中空纖維膜：聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜(廣州?？朴邢薰?，膜參數(shù)：內(nèi)徑900 μm、壁厚300 μm、孔徑0.02 μm).

硅膠填料：SP-100-10P(蘇州麥可旺公司，填料參數(shù)：SP-100-10-P 、粒徑10 um、孔徑100 A，比表面積450).β-環(huán)糊精：98%白色結(jié)晶粉末，25 °C下溶解度為1.85，熔點(diǎn)200 °C.上海山浦化工有限公司生產(chǎn).

丙酮、無(wú)水乙醇、甲醇、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、乙腈、乙酸乙酯、吡啶、正乙烷、二甲基甲酰胺、丙酮(所有等級(jí)的分析純度>99.9%，均為市售分析純).

氨基酸標(biāo)樣包括α -丙氨酸、β-丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、胱氨酸、賴(lài)氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、羥脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、谷酰胺、谷氨酸、天冬氨酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)).

1.2 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀( 美國(guó)熱電DSQII)，磁力攪拌器、超聲清洗儀、電子天平(上海精密儀器有限公司)、粉碎機(jī)、微波爐、恒溫水浴鍋.

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱： 采用熱t(yī)r-5 MS柱，30米×內(nèi)徑0.25毫米，0.25 μm厚度.進(jìn)樣口溫度：250 ℃.升溫程序：初始柱溫80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至230 ℃，保持1 min.再以5 ℃/min 升溫至280 ℃，保持4 min.載氣：氦氣(純度≥99.999%)，流速1 mL/min.進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣.進(jìn)樣量：1 μL.

1.3.2 質(zhì)譜條件

色譜與質(zhì)譜接口溫度：280 ℃.電離方式：電子轟擊源( EI) .監(jiān)測(cè)方式： 選擇離子掃描模式( SIM).電離能量： 70 eV.溶劑延遲： 4.4 min.

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

母液：分析天平稱(chēng)量各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50 mg(0.050 0 g)稀釋于50 mL容量瓶中，丙酮定容(先加約30 mL丙酮超聲溶解，不溶部分加少量純凈水繼續(xù)超聲，然后用丙酮定容)，得到1 mg/mL的母液.

其他濃度標(biāo)液：逐級(jí)稀釋?zhuān)葟哪敢褐杏靡埔汗苋? mL置于50 mL容量瓶中，丙酮定容，得到濃度為 0.1 mg/mL標(biāo)液，然后再?gòu)?.1 mg/mL的標(biāo)液中取5 mL置于50 mL容量瓶中.丙酮定容，得到濃度為 0.01 mg/mL溶液，然后再?gòu)?.01 mg/mL的標(biāo)液中取5 mL置于50 mL容量瓶中.丙酮定容，得到濃度為 0.001 mg/mL溶液，最后直至10-4mg/mL.在棕色試劑瓶中避光冰箱保存，待用.每個(gè)濃度進(jìn)樣后出現(xiàn)譜圖，八個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸必須保證有三個(gè)峰面積數(shù)值相近，然后計(jì)算平均面積，用Excel回歸出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣

每個(gè)濃度均取0.5 mL 置于小導(dǎo)夫管(1.5 mL)中，吹風(fēng)機(jī)低溫吹干丙酮后，取0.5 mL衍生化試劑(此實(shí)驗(yàn)用BSTFA做衍生化試劑)，微波爐中反應(yīng)60 s.衍生液每次1 μL進(jìn)樣.衍生液要盡快進(jìn)樣，隔夜的將失效不能用.

2.3 藜麥樣品處理

取藜麥樣品100 g，粉碎后過(guò)60目篩.精密稱(chēng)量1.00 g樣品粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中.在此錐形瓶中加25 mL 80%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取60 min，放冷再稱(chēng)定質(zhì)量.用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量.萃取液過(guò)濾轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度.

2.4 β-環(huán)糊精改性的硅膠微球制備

硅膠微球依次用1.0 M的鹽酸和氫氧化鈉進(jìn)行浸泡處理，用去離子水洗至中性，真空干燥后使用.取5.0 g上述活化微球與5.0 g環(huán)糊精混合后，倒入帶有攪拌器、冷凝管的三口燒瓶，依次加入三甲基氯硅烷(5 mL)和丙酮10 mL.最后加入NaOH(2.0 g)，溫度70 ℃，400 rpm攪拌反應(yīng)12 h.反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)濾后，先用大量熱水洗滌，再用丙酮浸洗后真空干燥.

2.5 中空纖維攪拌棒的制備

聚偏氟乙烯中空纖維膜用剪刀剪成長(zhǎng)為2 cm的小段，用丙酮在超聲波中清洗，除去纖維中的任何可能的雜質(zhì).中空纖維膜一端先用打火機(jī)密封，后在管腔內(nèi)插入一根1 cm長(zhǎng)的細(xì)鋼絲.將0.1 g硅膠填料分散在1 mL無(wú)水乙醇中，然后用注射器將分散溶液緩慢注入中空纖維內(nèi)腔.乙醇注入后會(huì)滲出和揮發(fā)，完成后再用打火機(jī)將中空纖維膜另一端密封.

2.6 樣品萃取及衍生過(guò)程

每次1 mL 藜麥提取液 + 中等濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1～0.001)1 mL+氯化鈉(0～0.1 g不等)+中空纖維攪拌棒1根.磁力攪拌萃取若干時(shí)間后取出攪拌棒，晾干或吹風(fēng)機(jī)低溫烘干，用 0.1 mL BSTFA+0.9 mL乙腈(要淹沒(méi)攪拌棒)微波爐中衍生1 min左右.

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸色譜圖

各分析物的保留時(shí)間和特征離子見(jiàn)表1.

3.2 藜麥氨基酸色譜圖

氨基酸色譜圖見(jiàn)圖2.由圖2可知，保留時(shí)間為6.4 min左右的氨基酸出峰最明顯.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品氨基酸出峰時(shí)間可知，該氨基酸可能為亮氨酸.加入中空纖維攪拌棒后，各個(gè)氨基酸的出峰比加入攪拌棒之前出峰明顯，原因是中空纖維膜避免了其他不必要的分子出峰.只有氨基酸和其他小分子物質(zhì)能出峰，所以加入攪拌棒萃取后的藜麥氨基酸更容易被提取.

圖2 藜麥氨基酸色譜圖

3.3 衍生時(shí)間的優(yōu)化

各衍生時(shí)間優(yōu)化見(jiàn)圖3.

衍生時(shí)間越長(zhǎng)越有利于目標(biāo)物進(jìn)入萃取液.在達(dá)到平衡后再增加衍生時(shí)間對(duì)萃取效率影響也不大.若在平衡后繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，將會(huì)導(dǎo)致液膜的不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致萃取溶液的損失及萃取效率的降低.研究過(guò)程中，在室溫條件下( 23 ℃左右) 對(duì)衍生時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)衍生時(shí)間在50 s時(shí)氨基酸萃取效果最佳.

圖3 衍生時(shí)間

3.4 鹽析濃度的優(yōu)化

各鹽析濃度優(yōu)化見(jiàn)圖4.

圖4 鹽析濃度

隨著鹽濃度增加，蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固阻塞.通過(guò)攪拌棒萃取控制NaCl的濃度，加入多于0.5 g的NaCl 以后，發(fā)現(xiàn)萃取效率大大降低.原因可能是發(fā)生了蛋白質(zhì)的變性，或者其他物質(zhì)進(jìn)入纖維膜，阻礙了氨基酸的萃取.

3.5 測(cè)定方法精密度

測(cè)定方法精密度見(jiàn)表1.

在確定的優(yōu)化條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)含有標(biāo)準(zhǔn)品的樣品( 按照2.1制備) 及藜麥樣品(按照2.6制備)進(jìn)行中空纖維膜液相微萃取，標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見(jiàn)圖1，藜麥譜圖見(jiàn)圖2.取n=3計(jì)算檢出限、定量限，標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表1.藜麥的檢出限在0.000 03 mg·mL-1～0.017 mg·mL-1之間，定量限在0.000 1 mg·mL-1～0.05 mg·mL-1之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.219%～0.892%.結(jié)果表明，本法具有良好的精密度要求.藜麥中八種氨基酸含量結(jié)果見(jiàn)表2.

3.6 藜麥中氨基酸含量

藜麥樣品中八種氨基酸的含量見(jiàn)表2.

表1方法精密度

表2 藜麥中氨基酸含量

采用中空纖維攪拌棒萃取后，控制其他變量相同，改變衍生時(shí)間和鹽析濃度.從圖3、圖4可知，衍生時(shí)間為50 s、鹽析濃度為0.05 g時(shí)，氨基酸最易析出.在藜麥樣品中，亮氨酸的含量最多的為0.031 2 mg/mL.由圖3、4還可知，優(yōu)化因素為可控的.例如衍生萃取時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于目標(biāo)物進(jìn)入萃取液.在達(dá)到平衡后再增加衍生萃取時(shí)間，對(duì)萃取效率增加影響不大.根據(jù)氨基酸種類(lèi)和性質(zhì)的不同，優(yōu)化因素對(duì)氨基酸的影響不同.藜麥樣品中含量最少的蛋氨酸，在這兩個(gè)優(yōu)化因素的條件下出峰都不是很明顯.由此可得，氨基酸含量是影響出峰面積的一個(gè)很重要的因素.

4 結(jié)論

采用中空纖維膜液相微萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定藜麥中的游離氨基酸，方法簡(jiǎn)單、試劑用量少，具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，還有較高富集倍數(shù)，能有效地降低檢測(cè)限，提高靈敏度，具有良好的回收率和檢測(cè)限.本方法廣泛適用于很多物質(zhì)的分析，不需要預(yù)處理和清潔的氨基酸就能直接提取衍生物.制備的攪拌棒也可重復(fù)利用，符合綠色化學(xué)的要求.

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