李向茸，王興隴，李 倩，鄧盈盈，梁浩勤，周 飚，馮若飛*

(1.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGF)，又稱類胰島素生長因子、生長激素介質(zhì)，是生長激素產(chǎn)生生理作用過程中必需的一種活性蛋白多肽物質(zhì).血清中含有多種胰島素樣生長因子，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)存在10種IGF-Ⅰ，其中包括7種哺乳動物和3種非哺乳脊椎動物的IGF-l[1].IGF-Ⅰ是一種受生長激素(GH)調(diào)節(jié)的單鏈堿性多肽，由70個氨基酸組成，分子量為7 649 Da，含3個二硫鍵.IGF-l基因定位于人類第12號染色體q23.2，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成.IGF-Ⅰ的主要生物功能為促進(jìn)各種細(xì)胞的生長、分化及蛋白質(zhì)合成[2-3]，是GH功能作用中的重要輔助調(diào)節(jié)因子[4].血清中游離IGF-Ⅰ還具有類似胰島素的降血糖活性作用[5-6].由于IGF-Ⅰ為全身性生長因子，臨床上可以通過測定血清中的IGF1的表達(dá)水平作為2型糖尿病、腫瘤、胃癌、乳腺癌等的診斷指標(biāo)[7-11].血漿中IGF-Ⅰ含量不高，且95%以上的IGF-Ⅰ會與結(jié)合蛋白形成復(fù)合物[12]，如果直接從血漿中提取、純化，技術(shù)難度較大.本試驗(yàn)根據(jù)大腸桿菌的偏愛密碼子設(shè)計并合成人IGF-Ⅰ核苷酸序列，并將其克隆到載體pUC57中，然后構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ.通過IPTG優(yōu)化誘導(dǎo)條件在E.coli中與GST蛋白實(shí)現(xiàn)融合可溶性表達(dá)，并利用建立的間接ELISA檢測方法對表達(dá)的hIGF-Ⅰ進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)hIGF-Ⅰ的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)提供依據(jù).

1 材料

1.1 菌株、載體

大腸桿菌BL21菌株、表達(dá)載體 pGEX-6P-1，均由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；1 000 bp plus DNA Ladder(中科瑞泰生物科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、SalⅠ、Prestained Protein Ladder等均購自(Fermentas公司)；凝膠回收試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)；50×TAE(上海生工生物工程有限公司)；T4 DNA連接酶(寶生物工程大連有限公司)；IPTG(GIBCO公司)；瓊脂糖ARAROSE G-10(GENE Company公司)；IGF-Ⅰ、兔抗IGF-Ⅰ IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；辣根化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司).

1.3 主要儀器

SW-CJ-1F生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；YLN-2000凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)(北京市亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所)；ZWY-2102C立式恒溫振蕩搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；6132生物分光光度計(Eppendorf公司)；PowerCycle SL 96 Gradient PCR擴(kuò)增儀(Biometra公司)；PowerPac Basic電泳儀(Bio-rad公司)；WD-9405D脫色搖床(北京六一儀器廠)；MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司).

2 方法

2.1 hIGF-Ⅰ基因的設(shè)計與合成

將GenBank上hIGF-Ⅰ核苷酸序列(A29117.1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并將合成的基因克隆到載體pUC57上，插入位點(diǎn)為SmaⅠ，由上海生工生物工程有限公司合成.序列優(yōu)化結(jié)果如下：5′-ggatccATGTTTGCGACTGCACGTGGATCCATGTTCCCGGCTATGCCACTGTCTTCCCTGTTTGTAAATGGACCGAGGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTTCAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACAAGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGCCTCAGACAGGTATGGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGAGCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCACCCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCTGTCGACCGCAACGGTTTCTCTCCGgtcgac-3′(小寫字母序列為雙酶切位點(diǎn)，下劃線部分為上、下游引物).

2.2 重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的構(gòu)建

分別用BamH I +Sal I雙酶切上述克隆載體pUC57-hIL-7和表達(dá)載體pGEX-6P-1，之后分別進(jìn)行純化，然后用T4 DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，依次進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定.測序鑒定完全正確的質(zhì)粒命名為pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ.

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化

2.3.1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

將測序鑒定正確的pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，挑取單克隆菌斑37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h.吸取上述菌液及pGEX-6P-1菌液各160 μL，分別加入至8 mL新鮮Amp+LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min搖菌約100 min，待OD600值為0.4時，向誘導(dǎo)組中加入40 μL誘導(dǎo)劑 IPTG(IPTG的終濃度為0.5 mmol/L)后，37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)9 h.

2.3.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

取出菌液1 mL，12 000 r/ min離心1 min收取菌體沉淀.加入0.01 mmol/L PBS重懸100 μL后，再加入100 μL的2×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性5 min.分別取出10 μL上述處理的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后用0.25 %考馬斯亮藍(lán)染色，經(jīng)過脫色處理，分析蛋白表達(dá)情況.

2.3.3 不同誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

分別吸取pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的單克隆菌液100 μL，加入到6個平行的5 mL Amp+ LB培養(yǎng)液中，37 ℃、 200 r/min搖菌培養(yǎng).于三組不同的菌濃度(OD600值為0.2、0.4、0.8)時加入不同濃度的IPTG(0.5 、1.0 mmol/L)，進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化.將以上菌液均在37 ℃、200 r/min搖菌9 h，之后分別以2.3.2步驟進(jìn)行SDS-PAGE檢測.

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的ELISA檢測

2.4.1 包被與封閉

用pH值為 9.0的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(包被緩沖液)將表達(dá)產(chǎn)物hIGF-Ⅰ(已知抗原)及陽性對照IGF-Ⅰ fragment稀釋至10 μg/mL.每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加100 μL，4 ℃過夜.次日洗滌1次，然后每孔加入封閉液(洗滌液+13%馬血清)150 μL，置室溫封閉2 h.甩掉封閉液并拍干，室溫晾干.

2.4.2 加入一抗及酶標(biāo)二抗

用 PBST 25倍稀釋兔抗IGF-Ⅰ制的 1∶25稀釋兔抗IGF-Ⅰ，選兩孔每孔加入100 μL一抗.再選兩孔每孔加入100 μL PBST作陰性對照，37 ℃水浴1 h，取出用PBST洗滌5次并拍干.然后加入1∶10 000稀釋的羊抗兔酶標(biāo)二抗(稀釋液為含13%馬血清的PBST)，每孔100 μL，37 ℃水浴45 min.

2.4.3 加入顯色液及終止液

用PBST洗滌5次并拍干.于各反應(yīng)孔中加入顯色劑A溶液(H2O2)、B溶液(TMB)各50 μL，37 ℃水浴避光顯色15 min.于各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸50 μL.在酶標(biāo)儀上，于主波長450 nm、次波長630 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD450/630值，若大于或等于規(guī)定的陰(-)性對照OD450/630值的2.1倍，即為陽(+)性.

3 結(jié)果與分析

3.1 重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的構(gòu)建

重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的構(gòu)建結(jié)果見圖1.

M. 1 000 bp plus DNA Ladder；1. pGEX-6P-1；2. pUC57-hIGF-Ⅰ雙酶切鑒定；3. pUC57-hIGF-Ⅰ；4. pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ；5. pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的雙酶切鑒定；6. pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的PCR鑒定.

由圖1可知，重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ經(jīng)BamHⅠ+SalⅠ雙酶切后，出現(xiàn)2條清晰的電泳條帶，約為4 900 bp和240 bp.PCR鑒定在240 bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，均與預(yù)期相符.測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對，與GenBank上的人IGF-Ⅰ核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%，表明重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ構(gòu)建成功.

3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化

重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化結(jié)果見圖2、圖3.

M. Prestained Protein Ladder；1. 未誘導(dǎo)pGEX-6P-1-IGF-Ⅰ；2. 誘導(dǎo)pGEX-6P-1；3. 誘導(dǎo)pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ.

由圖2可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ組在34 ku附近出現(xiàn)一條染色較深的蛋白帶，分子質(zhì)量大小與理論值相符，表明hIGF-Ⅰ蛋白被成功誘導(dǎo)表達(dá).

M. Prestained Protein Ladder；1. OD600值為0.2，IPTG濃度為0.5 mmol·L-1；2. OD600值為0.4，IPTG濃度為0.5 mmol·L-1；3. OD600值為0.8，IPTG濃度為0.5 mmol·L-1；4. OD600值為0.2，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1；5.OD600值為0.4，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1；6. OD600值為0.8，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1.

圖3不同誘導(dǎo)條件的優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知，在OD600值為0.8、IPTG濃度為0.5 mmol/L的條件下，電泳條帶最明顯.因此，圖3中的誘導(dǎo)條件為最佳誘導(dǎo)條件.

3.3 表達(dá)產(chǎn)物的ELISA檢測

生物分光光度計測定表達(dá)蛋白的濃度2.811 mg/mL，將表達(dá)產(chǎn)物hIGF-Ⅰ及陽性對照IGF-Ⅰ均稀釋至5 μg/mL包被酶標(biāo)板.

表1 hIGF-Ⅰ重組蛋白的ELISA檢測結(jié)果

由表 1可知，表達(dá)產(chǎn)物有抗原活性，但相比陽性對照活性較低.

4 討論與結(jié)論

hIGF-Ⅰ基因組含有5個內(nèi)含子和6個外顯子，其中成熟hIGF-Ⅰ肽鏈由3、4外顯子進(jìn)行編碼，4種hIGF-Ⅰ前體分子由3、4外顯子與其他幾種外顯子拼接所形成[13]，因此天然hIGF-Ⅰ的核苷酸序列不易利用反轉(zhuǎn)錄法獲得.目前，針對小分子蛋白質(zhì)及多肽的編碼基因主要利用化學(xué)合成法獲取.hIGF-Ⅰ僅含有70個氨基酸，為小分子蛋白.它與GST可以實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)，且26 ku的GST標(biāo)簽蛋白可用凝血酶、Xa因子和PreScission蛋白酶進(jìn)行去除，方便進(jìn)行下游純化.因此，實(shí)驗(yàn)采用人工合成的hIGF-Ⅰ基因，可成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ，并能實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中與GST蛋白的融合可溶性表達(dá).并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不同菌濃度和IPTG濃度的優(yōu)化，得出的最佳誘導(dǎo)條件OD600值為0.8、IPTG濃度為0.5 mmol/L，表達(dá)蛋白的濃度為2.811 mg/mL，且產(chǎn)物具有抗原活性.鑒于IPTG造價高昂并對人體存在一定的毒性，部分國家明確規(guī)定禁止IPTG使用于人用重組生物制劑的生產(chǎn)工藝中，因此在生產(chǎn)hIGF-Ⅰ工藝中可考慮選用無毒、廉價的乳糖作為tac啟動子的誘導(dǎo)劑[14].

IGF-Ⅰ從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)有40多年的歷史，它是一種重要的生物資源，在國際上已經(jīng)逐漸成為一種高效益的技術(shù)產(chǎn)業(yè)，但其研究成果更積極的意義在于創(chuàng)新藥物研究[15].目前，天然的IGF-Ⅰ已用于治療多種頑疾并取得較好的臨床效果.隨著社會與經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們對健康要求不斷提高，對新藥的需求也與日俱增，重組的IGF-Ⅰ具有良好的應(yīng)用前景[16].本試驗(yàn)中重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ雖在大腸桿菌中成功表達(dá)，但通過ELISA檢測表達(dá)的目的蛋白相對于陽性對照IGF-Ⅰ的OD450/630值較低.這說明其表達(dá)產(chǎn)物濃度較低且生物活性不高，因此對于提高重組載體的表達(dá)產(chǎn)率和可溶性蛋白產(chǎn)率等問題有待于進(jìn)一步探索.

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