邱兆磊，王振杰，程峰，鄭傳明，李磊，姜海，杜召輝

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 急診外科，安徽 蚌埠 233004）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是急性胰腺炎發(fā)展的重癥階段，常伴有重要臟器功能障礙，仍是并發(fā)癥多、死亡率高的疾病之一[1]。急性肺損傷是（acute lung injury,ALI）是SAP常見且嚴(yán)重并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)SAP出現(xiàn)肺損傷等多臟器衰竭的死亡率高達(dá)54%。

胸腺素α1（Thymosinα1,Tα1）是一種細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑[2]，具有促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌以及淋巴細(xì)胞的功能，而Tα1對(duì)SAP大鼠相關(guān)肺損傷的作用國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。本文通過復(fù)制SAP肺損傷大鼠動(dòng)物模型，探討Tα1在SAP大鼠肺臟損傷中的作用，觀察肺組織病理以及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的變化，為探索SAP肺損傷相關(guān)機(jī)制和保護(hù)性治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體重180～210 g，隨機(jī)平均分為3組：對(duì)照組（A組）、SAP組（B組）和Tα1 干預(yù)組（C組），每組各8只。

1.2 SAP模型復(fù)制和處理

所有大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。吸入性麻醉藥異氟烷（上海雅培制藥有限公司）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，無菌條件下行腹正中切口入腹。A組大鼠入腹后僅翻動(dòng)十二指腸及胰腺后即刻關(guān)腹；B組大鼠采用5%?；悄懰徕c（0.1 ml/100 g，美國(guó)Sigma公司）經(jīng)膽胰管逆行勻速緩慢注入（0.1 ml/min）復(fù)制SAP動(dòng)物模型；C組大鼠在復(fù)制模型前0.5 h經(jīng)腹皮下注射Tα1（6 mg/kg）（上海實(shí)業(yè)聯(lián)合集團(tuán)長(zhǎng)城藥業(yè)有限公司）。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

分別于復(fù)制模型成功后12 h處死各組大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血備用，取肺組織和胰腺組織用于光鏡病理學(xué)檢查。另一部分肺組織經(jīng)液氮置入-80℃冰箱冷凍保存，用于檢測(cè)肺組織細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule,ICAM-I）及TNF-α的蛋白表達(dá)。

1.3.1 各組大鼠血清淀粉酶檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清淀粉酶水平。

1.3.2 胰腺組織和肺組織病理學(xué)檢查 ①病理學(xué)檢查：胰腺、肺組織標(biāo)本以10%甲醛溶液常規(guī)固定、石蠟包埋、蘇木素-伊紅染色。②Western blot法檢測(cè)肺組織ICAM-I蛋白和TNF-α蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析和q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清淀粉酶及肺濕干比比較

3組血清淀粉酶及肺濕干比（W/D）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組與B組比較，C組降低（q=12.133，P=0.000），B組與A組比較，B組升高（q=35.688，P=0.000）。見表1。

2.2 胰腺、肺臟組織病理改變

B、C組胰腺組織可見腺泡水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有的間質(zhì)壞死，損傷較A組重；而C組胰腺組織損傷較B組減輕；A組胰腺組織未見明顯病理改變。見圖1～3。

B、C組肺組織間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、水腫，損傷較A組加重；C組肺組織損傷較B組減輕；A組肺組織未見明顯病理改變。見圖4～6。

表1 3組大鼠血清淀粉酶及肺W/D比較 （n=8，±s）

表1 3組大鼠血清淀粉酶及肺W/D比較 （n=8，±s）

組別 血清淀粉酶/（u/L） 肺W/D A組 1 107.42±83.80 1.71±0.24 B 組 6 378.31±537.22 3.26±0.14 C 組 4 586.42±477.41 2.14±0.33 F值 329.293 82.567 P值 0.000 0.000

2.3 各組肺組織ICAM-1和TNF-α蛋白表達(dá)比較

3組肺組織ICAM-1和TNF-α蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B、C組較A組升高（q=10.850和3.574，均P=0.000），C組較B組降低（q=7.276，P=0.000）。見表2和圖7。

圖1 A組胰腺組織病理改變 （HE染色）

圖2 B組胰腺組織病理改變 （HE染色）

圖3 C組胰腺組織病理改變 （HE染色）

圖4 A組肺組織病理改變 （HE染色）

圖5 B組肺組織病理改變 （HE染色）

圖6 C組肺組織病理圖 （HE染色）

表2 3組肺組織ICAM-1和TNF-α蛋白表達(dá)比較（n=8，±s）

表2 3組肺組織ICAM-1和TNF-α蛋白表達(dá)比較（n=8，±s）

組別 ICAM-1蛋白 TNF-α蛋白A組 0.53±0.17 0.47±0.15 B 組 1.38±0.20 1.42±0.27 C 組 0.81±0.28 0.71±0.22 F值 30.571 40.732 P值 0.000 0.000

圖7 3組肺組織ICAM-1和TNF-α蛋白表達(dá)

3 討論

SAP發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，病情危重，迄今缺乏特異性治療方法。SAP時(shí)會(huì)促使炎癥細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）及多臟器衰竭（multiple organ failure,MOF）是SAP死亡的重要因素[3]。目前研究認(rèn)為[4]，TNF-α、IL-6等是SAP引起全身炎癥反應(yīng)綜合征的強(qiáng)效介質(zhì)，其中TNF-α是最早產(chǎn)生并起關(guān)鍵作用的炎癥介質(zhì)，并且TNF-α可直接促使組織細(xì)胞壞死及蛋白酶激活[5]，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致組織出血及壞死。TNF-α可作為啟動(dòng)因子可引起瀑布樣連鎖及級(jí)聯(lián)效應(yīng)[6]，促使機(jī)體釋放氧自由基、前列環(huán)素、IL-6、緩激肽等，形成復(fù)雜和高度偶聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)體系，這種失控性的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)在SAP組織持續(xù)性損傷中起關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)與功能的改變、細(xì)胞壞死，產(chǎn)生ARDS、SIRS、MODS及DIC等。在炎癥反應(yīng)過程中，ICAM-1的表達(dá)受TNF-α調(diào)節(jié)，ICAM-1可和粒細(xì)胞的整合素相作用，介導(dǎo)白細(xì)胞的游出和緊密連接，導(dǎo)致組織器官損傷[7]。

本實(shí)驗(yàn)中B組大鼠復(fù)制模型成功12 h后血清淀粉酶、肺組織ICAM-1及TNF-α蛋白水平較A、C組升高，肺組織可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織水腫，損傷較重。肺是SAP發(fā)生時(shí)最先累及的胰腺外臟器，肺損傷時(shí)大量的炎癥介質(zhì)遷移到肺組織，釋放大量的炎癥介質(zhì)，對(duì)肺泡上皮及肺毛細(xì)血管上皮嚴(yán)重造成損害，引起肺不張及肺水腫等，最終導(dǎo)致多器官衰竭，病死率高達(dá)40%～50%[8-9]。SAP發(fā)生時(shí)，肺組織脂質(zhì)過氧化物迅速增高，NF-kB激活，TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)及ICAM-1等基因表達(dá)上調(diào)，炎癥介質(zhì)大量釋放，中性粒細(xì)胞的活化、浸潤(rùn)，產(chǎn)生過多的活性氧，導(dǎo)致肺組織炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)，可導(dǎo)致肺組織及毛細(xì)血管的損害，從而加重肺損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)中B組大鼠肺組織損傷較A、C組重，肺組織ICAM-1及TNF-α蛋白水平較A、C組升高。

Tα1是胸腺肽組分中活性最強(qiáng)的成分，在細(xì)胞免疫等方面具有重要調(diào)節(jié)作用[11]。Tα1在機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等病理生理過程中可通過作用于胸腺細(xì)胞，刺激T淋巴細(xì)胞的分化成熟，激活NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)前NK細(xì)胞的補(bǔ)充、成熟，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[12]，并可抑制有害炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。因此，Tα1具有增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫功能。Tα1調(diào)節(jié)作用是雙向性，其可以上調(diào)有益的細(xì)胞因子如干擾素、IL-2等，對(duì)有害的炎癥因子如TFN-α等可以下調(diào)。研究表明[13]，Tα1在聯(lián)合動(dòng)脈導(dǎo)管化療藥物灌注栓塞治療原發(fā)性肝癌安全性高，療效顯著；在治療惡性腫瘤過程中可提高CD4+/CD8+比值及NK細(xì)胞數(shù)量、功能，對(duì)于T淋巴細(xì)胞功能和骨髓造血功能均具有一定的保護(hù)作用[14]；在治療丙型肝炎肝硬化患者方面已取得滿意的效果[15]，而Tα1對(duì)SAP肺損傷的療效如何目前鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過用Tα1對(duì)SAP大鼠肺損傷進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明，B組大鼠肺組織TNF-α、ICAM-1及淀粉酶水平至復(fù)制模型成功后12 h升高，胰腺及肺組織可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫、出血。使用Tα1干預(yù)后，C組大鼠血清淀粉酶和肺組織TNF-α、ICAM-1蛋白水平較B組降低，胰腺及肺組織損害情況較B組減輕，但仍高于A組，本結(jié)果表明Tα1能夠降低SAP肺損傷大鼠炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子水平，能夠減輕SAP的肺組織壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，具有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過血清學(xué)檢查、蛋白水平分析Tα1對(duì)SAP大鼠肺損傷的保護(hù)作用，ICAM-1及TNF-α等炎癥介質(zhì)的下調(diào)，肺組織損傷減輕。由于SAP并發(fā)肺損傷是多炎癥因子參與的動(dòng)態(tài)過程[16]，早期安全有效地抑制這些炎癥介質(zhì)活性將有利于控制肺損傷的進(jìn)一步惡化，為臨床治療SAP患者提供了新的策略，其保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

[1]FROSSARD J L,STEER M,PASTOR C M.Acute pancreatitis[J].Landcet,2008,371(9607): 143-152.

[2]GARACI E.Thymosin alpha-l: a historical overview[J].Ann NY Acad Sci,2007,1112(1): 14-20.

[3]WANG Y Z,WANG S W,ZHANG Y C,et al.Protective effect of exogenous IGF-I on the intestinal mucosal barrier in rats with severe acute pancreatitis[J].World J Emerg Med,2012,3(3): 213-220.

[4]MOTHOFER K,CASTILLO CFD,FRICH T W,et al.Increased intrapancreatic trypsinogenactive ischemia induced experimental pancreatitis[J].Annual of Surgery,1995,221(4): 364-371.

[5]SENDLER M,DUMMER A,WEISS F U,et al.Tumour necrosis factor alpha secretion induces protease activation and acinar cell necrosis in acute experimental pancreatitis in mice[J].Gut,2013,62(3): 430-439.

[6]余佳,金浩,陳辰,等.聚ADP核糖聚合酶抑制劑對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肺炎癥介質(zhì)表達(dá)和肺損傷的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(1): 38-42.

[7]HSU W Y,CHAO Y W,TSAI Y L,et al.Resistin induces monocyte-endothelial cell adhesion by increasing ICAM-1 and VCAM-1 expression in endothelial cells via p38MAPK-dependent pathway[J].J Cell Physiol,2011,226(8): 2181-2188.

[8]劉松橋,邱海波.急性呼吸窘迫綜合征診治進(jìn)展[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2014,23(3): 248-251.

[9]MIKKELSEN M E,SHAH C V,MEYER N J,et al.The epidemiology of acute respiratory distress syndrome in patients presenting to the emergency department with severesepsis[J].Shock,2013,40(5): 375-381.

[10]武雅琴,蔣峰,黃建峰.辛伐他汀通過PI3K/Akt通路緩解肺泡Ⅱ型細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(11):1941-1943.

[11]呂永豐,陳清霞,李國(guó)成,等.烏司他丁對(duì)氟尿嘧啶植入劑治療肝癌手術(shù)后惡性胸腹水患者免疫功能的影響觀察[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,6(3): 254-256.

[12]MOODY T W.Thymosin alphal as a chemopreventive agent in lung and breast cancer[J].Ann N Y Acad Sci,2007,112(1): 297-304.

[13]黃祥忠,高峰,任冬青,等.胸腺素αl聯(lián)合動(dòng)脈導(dǎo)管化療藥物灌注栓塞治療原發(fā)性肝癌的療效觀察[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2012,16(15): 11-13.

[14]NAYLOR P H,QUADRINI K,GARACI E,et al.Immunopharmacology of thymosin alpha l and cytokine synergy[J].Ann NY Acad Sci,2007,1112: 235-244.

[15]章前標(biāo),范磊.胸腺素α1治療丙型肝炎肝硬化29例臨床分析[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志: 電子版,2013,7(24): 11873-11874.

[16]魏明,劉佳,涂玲,等.重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠磷脂酰肌醇-3激酶表達(dá)及其抑制劑對(duì)腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2015,24(1): 51-54.