劉美佳，于怡琳，姜 森，張 翔，葛 鋒，劉迪秋

(昆明理工大學 生命科學與技術學院， 昆明 650500)

珠子參(Panaxjaponicus)為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物，因根莖節(jié)間纖細，節(jié)膨大成球形念珠狀而得名，其根莖入藥。珠子參作為藥材，始載于《滇南本草》，為歷版《中國藥典》收載品種。藥用珠子參主產(chǎn)于云南，屬名貴常用中藥材，是彝族、納西族、白族、藏族、僳族等少數(shù)民族的傳統(tǒng)用藥。珠子參性味苦、甘、微寒，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有補肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血之功效，臨床上應用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛癆咳嗽、跌打損傷、關節(jié)疼痛、咳血、吐血、外傷出血等癥狀[1-2]。

珠子參皂苷(Panaxjaponicussaponins)為珠子參的主要活性成分，主要由達瑪烷型三萜皂苷和齊墩果烷型三萜皂苷構成。目前，已從珠子參根莖葉中分離出40多種皂苷成分，主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳa、Ⅳ和Ⅴ，人參皂苷R0、Re、Rd和Rb1等[3-5]。與珠子參同為人參屬的人參(Panaxginseng)主要含達瑪烷型皂苷，齊墩果烷型皂苷僅發(fā)現(xiàn)含量極微的人參皂苷R0；而三七(Panaxnotoginseng)只含達瑪烷型皂苷，不含齊墩果烷型皂苷[6-7]。珠子參所含皂苷組分與同屬人參、三七相比，在成分種類以及各組分含量上均存在明顯差異，因其含有大量齊墩果烷型皂苷，導致臨床上的用途比較特殊[8]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，珠子參皂苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善心肌缺血、增加腦血流量、抗腫瘤、免疫調節(jié)以及治療白細胞減少癥等功效[9-10]。

藥用植物三萜類皂苷主要由甲羥戊酸(MVA)途徑合成，因此珠子參皂苷也通過MVA途徑合成[11-12]。近年來，與珠子參親緣關系較近的人參、三七皂苷合成途徑研究已取得重要進展，皂苷生物合成的上游、中游路徑基本清楚，下游的皂苷骨架后修飾過程也在逐步獲得解析[13]。通過MVA途徑合成珠子參皂苷的過程如下：首先，兩分子乙酰輔酶A(acetyl-coA)經(jīng)過硫解反應縮合生成乙酰乙酰輔酶A(acetoacetyl-coA)，此反應需在乙酰輔酶A?；D移酶(acetyl-coA acyltransferase，AACT)的催化下完成(其中乙酰乙酰輔酶A是由一分子乙酰輔酶A脫去一個乙酰跟另一分子乙酰輔酶A乙酰基結合從而生成的物質)。乙酰乙酰輔酶A在乙酰輔酶A及羥甲酰戊二酰輔酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthase，HMGS)的作用下合成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)。HMG-CoA在關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的催化作用下合成了甲羥戊酸(MVA)，珠子參皂苷的合成正式進入到MVA途徑，HMGR也因此成為MVA途徑的首個關鍵酶[14]。隨后，經(jīng)過異戊烯基焦磷酸(IPP)、鯊烯合成酶(SS)、 鯊烯環(huán)氧酶(SE)和法呢基焦磷酸(FPS)等一系列催化反應，生成2, 3-氧化鯊烯，它是三萜皂苷及植物甾醇等的共同前體物質。2, 3-氧化鯊烯由達瑪烯二醇合酶(DS)催化進入達瑪烷型皂苷合成支路，同時，經(jīng)由β-香樹脂合成酶(AS)催化，進入齊墩果烷型皂苷合成支路(圖1)。

近年來，對于珠子參皂苷的研究多集中于有益于人類健康及疾病防治的藥理學領域，而珠子參皂苷生物合成途徑相關基因的調控研究較少。已有研究表明HMGR是甲羥戊酸途徑的第一個關鍵酶，通過調控HMGR基因的表達影響盾葉薯蕷皂苷的生物合成[15]；此外，Tansakul等[16]研究表明過表達人參皂苷合成途徑中關鍵酶基因會導致人參皂苷積累量的變化。由于珠子參與人參、三七同屬，因此對珠子參皂苷生物合成中關鍵酶基因進行調控也可能會影響皂苷的合成。本研究選取珠子參皂苷生物合成途徑中關鍵酶基因PjHMGR為研究對象，在珠子參細胞中過表達該基因，明確PjHMGR的功能及其在皂苷合成過程中的地位，為獲得高效、穩(wěn)定的珠子參皂苷合成調控技術提供理論參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

珠子參藥材來源于云南省玉龍縣珠子參大棚，經(jīng)云南大學虞泓教授鑒定為珠子參(Panaxjaponicus)，本研究所用珠子參材料是本實驗室誘導并培養(yǎng)的珠子參愈傷組織。研究所用農桿菌感受態(tài)細胞EHA105、大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1和植物過表達載體pCAMBIA2300s均由本實驗室保存；克隆載體pGEM-T和M-MVL逆轉錄試劑盒均購買于Promega公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方 法

1.2.1珠子參RNA提取和cDNA第一鏈合成采用兩步法提取珠子參總RNA。首先通過改良的異硫氰酸胍法進行初提，隨后通過酚和氯仿抽提以及DNA酶消化處理純化后，獲得純度較好的珠子參總RNA[17]。cDNA第一鏈的合成利用M-MVL逆轉錄試劑盒完成，將獲得的cDNA 置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

HMGR.3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；FPS.法呢基焦磷酸；SS.鯊烯合成酶；SE.鯊烯環(huán)氧酶；DS.達瑪烯二醇合成酶；AS.香樹脂合成酶；CAS.環(huán)阿屯醇合成酶；GT.葡萄糖基轉移酶；P450.細胞色素P450圖1 珠子參皂苷及植物甾醇生物合成途徑HMGR.3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase; FPS.Farnesylpyrophosphate synthase; AS.Amysyrin synthase; SS.Squalene synthase; SE.Squalene epoxidase; DS.Dammarenediol-II synthase; CAS.Cycloartenol synthase; GT.Glucosyl transferase; P450.Cytochromes P450Fig.1 The synthesis pathway of P. japonicus saponins and plant sterols

1.2.2PjHMGR基因克隆本研究首先根據(jù)NCBI公布的人參HMGR基因(AGV26444.1)設計特異性引物，以珠子參細胞RNA逆轉錄形成的cDNA為模板進行PCR擴增與測序，初步獲得了珠子參HMGR基因序列。以獲得的珠子參HMGR基因序列ORF為模板，設計特異引物PjHMGR-BamHⅠ-F(5′-CGCGGATCCCACCGAATCCTCCCACTAC-3′)和PjHMGR-KpnI-R(5′-CGGGGTACCTGACATATCCCGGCTTGAC-3′)，再次PCR擴增及測序確認?？寺◇w系為：cDNA 模板5.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，Extaq酶 0.5 μL，dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L上下游引物 0.5 μL，Nuclease-free water(無核酸酶的水) 34.5 μL，總體系為50.0 μL。反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共32個循環(huán)；結束后72 ℃延伸7 min。利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，對所得目的基因片段進行提取與純化，并與克隆載體pGEM-T連接，篩選陽性菌株并測序，最終獲得了珠子參生物合成途徑中關鍵酶基因PjHMGR的cDNA序列。菌液測序和引物合成均由上海生物工程技術服務有限公司完成。

1.2.3PjHMGR基因過表達載體構建和陽性細胞系抗性初篩通過BamH I和KpnI限制性內切酶構建過表達重組載體pCAMBIA2300s-PjHMGR。通過熱激轉化法將重組載體轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性菌株。通過液氮凍融法將上述陽性菌種質粒轉入EHA105農桿菌感受態(tài)細胞中，將上述農桿菌侵染普通的珠子參細胞獲得PjHMGR轉基因珠子參陽性株系。

提取生長狀態(tài)良好的PjHMGR轉基因珠子參陽性系基因組DNA，以卡那霉素抗性基因nptⅡ目的條帶為模板， 設計特異引物nptⅡ-F(5′-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3′)和nptⅡ-R(5′-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3′)。PCR檢測體系為：DNA模板 1.5 μL，10×EasyTaqBuffer 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，DNA Polymerase 5.0 μL，10 μmol/L的上下游引物 0.2 μL，Nuclease-free water 14.5 μL，總體積為20.0 μL。PCR反應程序為95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共32個循環(huán)；結束后72 ℃ 延伸7 min。PCR反應的產(chǎn)物通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4轉基因珠子參細胞系熒光定量分析和HMGR酶活測定PjHMGR基因表達水平通過熒光定量PCR檢測。轉基因珠子參陽性株系RNA提取和純化與1.2.1方法一致。熒光定量和內參的特異性引物為18srRNA-F(5′-AACCATAAACGATGCCGACCAG-3′)、18srRNA-F(5′-TTCAGCCTTGCGACCATACTCC-3′)、qHMGR-F(5′-TCCACAGCCTACTGATGAT-3′)和qHMGR-R(5′-GGGCAAACTAATGAGAAACTAC-3′)。整個反應通過GoTaq?2-Step RT-qPCR System (Promega, USA)完成，具體程序設置為94 ℃預變性 30 s；94 ℃變性 5 s，60 ℃退火反應 30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)；結束后72 ℃延伸9 min。

通過改良的紫外分光光度計法測定轉基因珠子參陽性株系酶活。采用0.1 mol·L-1蔗糖，0.05 mol·L-1氯化鈉，0.04 mol·L-1磷酸二氫鉀，0.03 mol·L-1EDTA鈉鹽構成的Buffer A和加入0.02 mol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)Buffer A的Buffer B提取珠子參PjHMGR的可溶性微粒體蛋白?？捡R斯亮藍法測定PjHMGR微粒體蛋白濃度，在340 nm處用紫外分光光度計測定空白對照和上述轉基因樣品的吸光度，并根據(jù)下列公式[酶活(μmol·mg-1·min-1)= (Δ340/min樣品-Δ340/min空白)/12.44×V×M]計算PjHMGR酶活。

1.2.5轉基因珠子參細胞系皂苷和植物甾醇含量測定準確稱取珠子參皂苷標準品10 mg，用適量甲醇溶解。分別以吸光值、珠子參總皂苷含量為橫縱坐標繪制珠子參皂苷標準曲線。用甲醇溶液溶解適量轉基因珠子參細胞系粉末，再以超聲法提取珠子參總皂苷粗提物，HPD100大孔樹脂純化珠子參總皂苷。以香草醛-高氯酸-冰乙酸顯色反應為基礎，利用標準曲線測定上述轉基因珠子參細胞系的總皂苷含量。

稱取干燥至恒重的轉基因珠子參細胞系1.0 g，以石油醚作為溶劑，以氫氧化鉀-乙醇溶液的皂化反應、正己烷萃取為基礎，通過索式提取方式獲取轉基因珠子參陽性細胞系植物甾醇提取物。根據(jù)乙酸酐-濃硫酸顯色反應測定植物甾醇含量，并以吸光值、植物甾醇濃度為橫縱坐標繪制標準曲線。利用標準曲線計算轉基因樣品植物甾醇含量。

1.2.6統(tǒng)計分析本實驗所有數(shù)據(jù)均來源于3組獨立重復實驗，計算標準差平均值，進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 PjHMGR轉基因珠子參細胞系

本實驗采用同源克隆法得到了珠子參HMGR基因的ORF全長序列，命名為PjHMGR，提交到NCBI 的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MG712296，該序列包含一個1 716 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼571個氨基酸。PjHMGR基因編碼蛋白序列與人參、三七、刺五加、常春藤的氨基酸序列比對結果顯示：PjHMGR基因編碼蛋白與其他藥用植物HMGR一樣具有多個保守的結構域，分別為TTEGCLVA、GTVGGGT、DMAMGMNM、EMPIGYVIP和2個KT保守結構域。以上結果表明HMGR功能結構域在進化過程中具有較高的穩(wěn)定性。通過農桿菌遺傳轉化操作，本研究獲得了7株具有抗性的轉PjHMGR細胞系，并依次編號為H-1～H-7，分別提取陽性細胞系的基因組DNA，以nptII-F和nptII-R為特異性引物進行 PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，所有細胞系在大約450 bp處均有與預期大小一致的特異性條帶(圖2)。

2.2 PjHMGR基因表達及HMGR活性分析

以上述H-1～H-7株系的cDNA為模板進行PjHMGR基因相對表達量分析。結果顯示陽性細胞系中，PjHMGR基因相對表達量與野生型相比均有不同程度提高。H-3和H-7株系PjHMGR基因相對表達量增加最多，約為野生型對照組的7.15倍，而H-5株系僅僅為對照組的1.47倍(圖3)。酶活分析表明，H-1～H-7轉基因珠子參陽性細胞系HMGR活性與野生型相比均有一定提高，并以H-3株系PjHMGR酶活最高，約為野生型株系的6.14倍(圖4)。各陽性細胞系PjHMGR基因表達量變化趨勢基本與酶活變化具有較好對應關系。

M. DL2 000；1～7.轉基因珠子參細胞系；8.陰性對照；9.陽性對照圖2 PjHMGR轉基因珠子參細胞系的nptII基因的PCR檢測M. DL2 000; 1-7. The transgenic P. japonicus cell lines; 8. Negative control; 9. Positive controlFig.2 The PCR detection of nptII gene in transgenic P. japonicus cell lines of PjHMGR

2.3 皂苷及植物甾醇含量分析

H-1～H-7中珠子參總皂苷含量與未轉基因珠子參細胞系相比有明顯提高。在整個實驗組中，H-3和H-7株系總皂苷含量約為野生型對照組的3.5倍，也明顯高于其他陽性細胞系(圖5)。同時，轉基因珠子參陽性細胞系中植物甾醇含量與野生型相比均有不同程度增加(圖5)。因此過表達PjHMGR不僅可以有效提高珠子參主要活性成分皂苷含量，也可以提高植物甾醇含量。

WT.野生型珠子參細胞系；H-1～H-7.PjHMGR轉基因珠子參細胞系。下同圖3 野生型和轉PjHMGR基因珠子參細胞系的PjHMGR基因相對表達量WT.The wild-type P. japonicus cell lines; H-1-H-7.The transgenic P. japonicus cells of PjHMGR. The same as belowFig.3 Relative expression of PjHMGR in wild-type and transgenic P. japonicus cell lines

圖4 野生型和轉PjHMGR基因珠子參細胞系的HMGR活性Fig.4 Enzyme activities of HMGR in the wild-type and the PjHMGR transgenic P. japonicus cell lines

3 討 論

人參屬三大藥材中，人參、三七備受關注且研究頗多，珠子參雖為中國傳統(tǒng)名貴中藥，卻長期缺乏系統(tǒng)認識和研究。近年來，越來越多研究證明珠子參具有廣泛而重要的藥理學活性，對此相關基礎研究逐步受到重視。三萜皂苷是珠子參主要生物活性成分，因此對其生物合成途徑的研究尤為重要。從我們課題組前期對三七皂苷生物合成的研究中發(fā)現(xiàn)，在分子水平上影響人參屬三萜皂苷合成的關鍵因素包括關鍵酶基因活性和轉錄因子活性。

目前，珠子參關鍵酶基因的克隆已取得了一些進展。Huang等[18]首次從珠子參細胞中克隆到關鍵酶基因PjAS，該基因是控制皂苷合成流向齊墩果烷皂苷的第一個關鍵酶基因。此外，珠子參關鍵酶基因PjDS、PjSS、PjFPS也相繼被克隆[19]。HMGR是植物三萜皂苷合成途徑中第一個關鍵酶，但針對于該關鍵酶的研究主要集中于五加科其他物種，包括邢朝斌等[20]克隆了長度為1 713 bp、編碼570個氨基酸的刺五加(Acanthopanaxsenticosus)HMGR基因，與人參(Panaxginseng)的PgHMGR(AD180346)具有92.3%的相似性；羅紅梅等[21]克隆了長度為1 770 bp、編碼589個氨基酸的人參(Panaxginseng)HMGR2(JX648390)基因，與西洋參(Panaxquinquefolius)的PqHMGR(ACV65036)具有99%的相似性。我們課題組曾經(jīng)從三七(Panaxnotoginseng)中克隆到編碼574個氨基酸的PnHMGR(KJ578757)基因，其與人參PgHMGR(ADI80346.1)序列具有97%的相似性。本研究成功克隆了長度約為1 716 bp，編碼571個氨基酸的珠子參PjHMGR(MG712296)序列，與張萍等[22]克隆PnHMGR(KJ578757)具有97%的相似性，該結果表明本實驗克隆的HMGR基因的完整性和準確性相對較高。

圖5 野生型和轉PjHMGR基因珠子參細胞系的總皂苷和甾醇含量Fig.5 The content of total saponins and phytosterol of the wild-type and PjHMGR transgenic P. japonicus cell lines

調控珠子參皂苷含量策略主要從兩個層面展開。一是細胞水平上調控，即對珠子參植株進行寒冷、干旱等脅迫，使皂苷含量增加，該方法操作層面粗放，效果一般，難以實現(xiàn)對皂苷合成的穩(wěn)定調控，只能影響“量”的變化而不能從根本上解決“質”的問題[23]。二是從分子水平，即通過直接控制皂苷合成的關鍵酶基因以及相關轉錄因子基因的表達影響皂苷合成，進而形成定向、高效、可靠的皂苷合成調控手段。分子操作是控制皂苷合成的終極途徑。本研究通過過表達珠子參HMGR基因直接促進珠子參皂苷的生物合成，提高皂苷含量。HMGR是植物萜類合成途徑中的第一個關鍵酶，它不僅是MVA途徑的第一個限速酶，也是三萜化合物合成的重要調控點[24]。國內外對HMGR基因的功能性研究已經(jīng)取得了一些進展。將人參關鍵酶基因PgHMGR過表達載體轉化到人參發(fā)根中，可引起人參皂苷含量的增加，該轉基因人參發(fā)根中皂苷含量與野生型相比平均提高了2倍以上[25]。此外，將人參關鍵酶基因PgHMGR1過表達載體轉化到擬南芥中，同樣可提高擬南芥中皂苷的積累量[26]。在青蒿素合成研究方面，HMGR能夠限制黃花蒿中青蒿素的生物合成，過表達HMGR基因可增加青蒿素的含量[27]。刺五加的各個器官均可表達HMGR，增加刺五加細胞中HMGR基因的表達量可以促進刺五加總皂苷的合成[28]。前期研究表明，在三七細胞中同時過表達PnHMGR與PnSS，三七皂苷的生物合成能力可提高約4倍，相對于僅過表達1個關鍵酶基因來說同時過表達2個關鍵酶基因對皂苷合成的影響確實明顯[29]。本研究還發(fā)現(xiàn)，皂苷合成被促進的同時，植物甾醇合成也被促進，其原因在于PjHMGR是三萜合成途徑中比較上游的關鍵酶，植物甾醇與三萜皂苷的合成共享上游和中游路徑，因此PjHMGR的表達增加，提高了整個代謝流的流量，流向三萜皂苷合成支路的代謝流增加的同時，植物甾醇合成支路的流量也隨之增加，最終導致珠子參皂苷和植物甾醇的合成同時獲得促進。

本研究實現(xiàn)了PjHMGR在珠子參細胞中的過表達，提高了珠子參皂苷的積累量，證明了PjHMGR確實是珠子參皂苷生物合成途徑中能夠顯著影響三萜皂苷以及植物甾醇的合成的關鍵酶。接下來，將重點研究關鍵酶基因與重要轉錄因子的相互作用，力圖把關鍵酶調控層面與轉錄因子調控層面結合起來，構建更為高效、科學的皂苷調控手段，全方位、多角度解析珠子參皂苷的合成機制。

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