陳蔚潔，楊愛江,2,3*，胡 霞,2，李 聰，王 麗

(1 貴州大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025；2 貴州大學(xué) 環(huán)境工程規(guī)劃設(shè)計(jì)研究所，貴陽 550025；3 貴州大學(xué) 科技園發(fā)展有限公司，貴陽 550025)

銻(Sb)是一種非生命必需的元素[1]，過去數(shù)十年被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)半導(dǎo)體、制造PET(聚對(duì)苯二甲酸乙二酯)的催化劑、剎車片、彈藥、阻燃劑、醫(yī)藥等行業(yè)，有著巨大的市場需求[2]。而中國是世界上主要的產(chǎn)Sb國，約占世界Sb產(chǎn)量的87%[2]。Sb因?yàn)槠渲掳┬缘雀鞣N危害而被歐盟巴塞爾公約列入危險(xiǎn)廢物[3]。隨著Sb在各行各業(yè)的大量使用以及Sb礦的大規(guī)模開采，大量Sb進(jìn)入到大氣、地表水、地下水和土壤中，嚴(yán)重威脅環(huán)境安全[4]。朱靜等研究發(fā)現(xiàn)湖南錫礦山(世界銻都)礦區(qū)的溪流中銻濃度為37～241 μmol/L，遠(yuǎn)高于中國地表水標(biāo)準(zhǔn)中Sb的含量[5]。伴隨環(huán)境生物學(xué)的發(fā)展，重金屬形態(tài)對(duì)各類生物生理生態(tài)效應(yīng)已成為生態(tài)毒理學(xué)的研究熱點(diǎn)。自然環(huán)境中銻表現(xiàn)多種價(jià)態(tài)，但主要為三價(jià)化合物[Sb(Ⅲ)]和五價(jià)化合物[Sb(Ⅴ)]存在，Sb的毒性與其形態(tài)密切相關(guān)，與無機(jī)銻相比有機(jī)銻的毒性相對(duì)較弱，其Sb(Ⅲ)的毒性是Sb(Ⅴ)的10倍以上[1]。

藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有著重要的作用。因其對(duì)有毒物質(zhì)較敏感、易獲得、個(gè)體小、易繁殖等一系列的優(yōu)點(diǎn)，常作為水體污染的測(cè)試材料[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，藻類在重金屬離子脅迫下會(huì)對(duì)其細(xì)胞的分裂、光合放氧和細(xì)胞膜透性等產(chǎn)生影響[7]。Maeda 等報(bào)道，藻類對(duì)高濃度Sb具有生物積累作用[8]，普通小球藻(Chlorellavulgaris)積累的Sb濃度為12 mg·g-1，其生長狀況在高濃度Sb脅迫下并沒有受到明顯影響，這可能是因?yàn)槠胀ㄐ∏蛟逵衅洫?dú)特的解毒機(jī)制，即通過將吸收的Sb(Ⅲ)轉(zhuǎn)化為毒性更低的Sb(Ⅴ)，進(jìn)而保護(hù)自身細(xì)胞安全[9]。光合作用是綠色植物最重要的生命活動(dòng)[10]，高濃度的重金屬脅迫會(huì)對(duì)微藻的光合作用產(chǎn)生影響，造成藻類細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化、葉綠體破壞、線粒體損傷，影響植物的光合作用，從而抑制藻細(xì)胞生長[11]。Sb對(duì)藍(lán)藻(Synechocystissp.)的毒性效應(yīng)主要體現(xiàn)在對(duì)光合系統(tǒng)的影響上，對(duì)光合放氧和光系統(tǒng)中電子傳遞和能量轉(zhuǎn)移等過程產(chǎn)生抑制[12]。斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)也因其易培養(yǎng)且對(duì)毒物反應(yīng)敏感等特點(diǎn)常被選作水質(zhì)評(píng)價(jià)的指示生物[13-14]，本研究主要考察不同濃度Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下斜生柵藻(自養(yǎng)條件)細(xì)胞生長、光合色素含量以及抗氧化酶系統(tǒng)活力等生理方面的變化情況，以便為重金屬脅迫下微藻抗性機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)主要儀器包括智能人工氣候箱(RXZ-500D型，上海圣科設(shè)備有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、紫外可見光分光光度計(jì)(1800PC，上海美普達(dá))、場發(fā)射掃描電鏡(SIGMA500，德國卡爾蔡司公司)等。本試驗(yàn)中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)分別選用酒石酸銻鉀和焦銻酸鉀，均為市售分析純，分別用去離子水配制成終濃度為0、100、200、400、800 μmol/L的銻溶液母液待用；丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所用斜生柵藻來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB-12)，用BG-11培養(yǎng)基對(duì)柵藻擴(kuò)大培養(yǎng)[16]，選用對(duì)數(shù)生長期的藻細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

1.2.1藻種培養(yǎng)首先對(duì)柵藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再將對(duì)數(shù)期的藻接入到500 mL的無菌三角瓶中，并加入不同濃度的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液，使最終藻液體積為200 mL，后用無菌膜對(duì)三角瓶進(jìn)行封口，放置于人工氣候箱中。氣候箱培養(yǎng)溫度設(shè)置為(25±1)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，靜置培養(yǎng)。為防止柵藻附著在燒瓶的內(nèi)壁，每6 h搖動(dòng)1次。

1.2.2實(shí)驗(yàn)處理按照1.2.1所設(shè)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)斜生柵藻，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ) 各分別設(shè)置5個(gè)處理濃度水平，分別為0、100、200、400、800 μmol/L(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示斜生柵藻對(duì)此濃度范圍脅迫響應(yīng)的差異較為明顯)，每個(gè)濃度水平設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。共計(jì)培養(yǎng)8 d，期間每天取樣用于測(cè)定不同價(jià)態(tài)銻脅迫下斜生柵藻的生物量、葉綠素a含量的動(dòng)態(tài)變化情況。同時(shí)，以BG-11培養(yǎng)基作為對(duì)照組(CK)，以800 μmol/L Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液脅迫處理作為實(shí)驗(yàn)組，共計(jì)培養(yǎng)8 d，每天取樣用于分析丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性變化情況。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1生物量藻細(xì)胞密度和665 nm處吸光度具有很好的線性關(guān)系。因此，每隔24 h取樣1次，測(cè)定665 nm處光密度(OD665)，其生長狀況(生物量)以分光光度計(jì)測(cè)定的光密度值表示(OD665)[21]。

1.3.2葉綠素a含量取培養(yǎng)8 d后1 mL藻液6 000 r/min離心10 min，用95%乙醇重懸浮提取葉綠素，以95%的乙醇為參比，測(cè)定上清液在665 nm與649 nm處的吸光度值(A665和A649)。然后，根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a含量：

葉綠素a含量(μg/mL)=13.7A665-5.76A649

1.3.3藻液丙二醛(MDA)和抗氧化酶活性取經(jīng)過800 μmol/L Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液脅迫處理8 d后的藻液10 mL，6 000 r/min離心10 min，去掉上層清液，剩余藻泥，在冰浴條件下研磨，用蛋白提取液并在冰浴中提取2 h，制備成酶提取液(50 mmol·L-1磷酸緩沖液)。分別用南京建成生物工程研究所開發(fā)的丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒，以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定試劑盒測(cè)定各相應(yīng)成分的含量和活性。

1.3.4Sb脅迫后柵藻微觀形貌變化情況取經(jīng)過100、200、400、800 μmol/L Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液脅迫處理8 d后的藻液，6 000 r/min離心10 min，去掉上層清液，剩余藻泥放置冰箱冷凍后，再經(jīng)冷凍干燥機(jī)脫水24 h后，收集藻粉。在2.5%戊二醛中固定2 h，用新鮮配制的0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，最后用系列乙醇(脫水劑的乙醇濃度依次為 30%～50%～70%～80%～90%～100%)兩次脫水,醋酸異戊酯置換后，CO2臨界點(diǎn)干燥，取正常清洗干燥后的柵藻，用導(dǎo)電膠粘于樣品臺(tái)上，噴金，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行表面觀測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)制圖采用Origin7.5軟件完成，對(duì)葉綠素a含量和抗氧化系統(tǒng)酶活性結(jié)果采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和組間差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著差異。

斜生柵藻的生長抑制率(I)=(1-N/N0)×100；N0為對(duì)照組的吸光度，N為實(shí)驗(yàn)組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對(duì)斜生柵藻生長的影響

Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理斜生柵藻生物量隨著處理時(shí)間整體呈上升趨勢(shì)(圖1)。其中， 在低濃度(100 μmol/L)的Sb(Ⅲ)脅迫下，斜生柵藻生物量在脅迫初期(1～3 d)受到一定的刺激作用，與對(duì)照組均表現(xiàn)出逐漸增加的生長趨勢(shì)，而在隨后的脅迫時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出明顯抑制；柵藻的生長在200、400和800 μmol/L Sb(Ⅲ)脅迫處理初期就受到極顯著抑制(P<0.01)，且隨著脅迫時(shí)間的增加抑制作用表現(xiàn)得更為明顯，三者生物量在脅迫第8天時(shí)分別為對(duì)照組的64.58%、62.25%、57.0%(圖1，A)。同時(shí)，在Sb(Ⅴ)脅迫處理中，100、200和400 μmol/L濃度處理在實(shí)驗(yàn)初期(1～3 d)對(duì)柵藻生長產(chǎn)生了一定促進(jìn)作用，而在隨后的脅迫時(shí)間內(nèi)均表現(xiàn)出明顯抑制作用；而800 μmol/L Sb(Ⅴ)濃度處理在實(shí)驗(yàn)期間(1～8 d) 對(duì)柵藻生長整體表現(xiàn)強(qiáng)烈抑制作用(P<0.01)，其柵藻生物量在實(shí)驗(yàn)第8天時(shí)僅為對(duì)照組的51.34%(圖1，B)?？梢?，斜生柵藻生長在低濃度Sb(Ⅲ)和中低濃度Sb(Ⅴ) 短期處理下得到促進(jìn)，而在高濃度Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ) 長時(shí)間脅迫下受到顯著抑制，且Sb(Ⅲ)的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于Sb(Ⅴ)。

圖1 不同濃度Sb(Ⅲ)(A)和Sb(Ⅴ)(B)處理下斜生柵藻生長情況Fig.1 The growth of Scenedesmus obliquus under different concentrations of Sb(Ⅲ) (A) and Sb(Ⅴ) (B)

2.2 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對(duì)斜生柵藻葉綠素a含量的影響

斜生柵藻葉綠素a含量在100、200、400和800 μmol/L的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫8 d后變化情況如圖2所示。其中，柵藻葉綠素a含量在低濃度時(shí)(100 μmol/L) Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下比對(duì)照組(0 μmol/L)略有增加；但在 200、400和800 μmol/L濃度 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下，其葉綠素a含量均比對(duì)照組明顯降低，且脅迫濃度越高降低幅度越大。尤其當(dāng)Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫濃度為800 μmol/L時(shí)，柵藻細(xì)胞葉綠素a含量均顯著低于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的73.53%和91.37%(P<0.01)。以上結(jié)果說明中高濃度的Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫均明顯降低了斜生柵藻葉綠素a含量，且濃度越高降幅越大，Sb(Ⅲ)降幅又大于Sb(Ⅴ)。

2.3 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對(duì)斜生柵藻丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

首先，斜生柵藻丙二醛(MDA)含量隨著800 μmol/L Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫時(shí)間的延長而呈升高的趨勢(shì)，并不同程度地高于同期對(duì)照組，且脅迫時(shí)間越長增幅越大 (圖3,A)。其中，Sb(Ⅲ)脅迫處理柵藻MDA含量隨脅迫時(shí)間增加而逐漸升高，從脅迫起始時(shí)的1.125 4 nmol·mg-1升高至第8天的(2.220 4±0.065) nmol·mg-1；與此同時(shí)，Sb(Ⅴ)脅迫處理組MDA含量隨脅迫時(shí)間表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，并在第6天時(shí)達(dá)到最大值 (1.987 4±0.021) nmol·mg-1，然后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第8天時(shí)MDA含量為(1.896 8±0.045)nmol·mg-1，但此時(shí)仍顯著高于同期對(duì)照組(P<0.01)。Sb(Ⅲ)脅迫處理柵藻MDA含量除脅迫處理第3、4天外均不同程度高于Sb(Ⅴ)脅迫組，尤其是脅迫后期表現(xiàn)得更明顯(P<0.01)。

*和**分別表示處理與對(duì)照組間在0.05和0.01水平存在顯著差異；下同圖2 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下斜生柵藻葉綠素a含量的變化* and ** indicate significant difference between treatment and control at 0.05 and 0.01 level, respectively; The same as belowFig.2 The chlorophyll a content of S. obliquus under different concentrations of Sb (Ⅲ) and Sb(Ⅴ)

圖3 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下斜生柵藻丙二醛含量及抗氧化酶活變化Fig.3 MDA content and antioxidant activities of S. obliquus under Sb(Ⅲ) and Sb(Ⅴ) stress

其次，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理組斜生柵藻超氧化物歧化酶(SOD)活性隨脅迫時(shí)間的增加均表現(xiàn)出逐漸上升趨勢(shì)，并不同程度地高于同期對(duì)照，且處理時(shí)間越長差異越大(圖3，B)。其中，對(duì)照組柵藻SOD活性先從培養(yǎng)初期的5.324 0 U·mg-1快速上升到第4天的(6.485 4±0.19) U·mg-1，隨后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)并趨于平穩(wěn)，第8天達(dá)到 (6.407 2±0.23) U·mg-1；Sb(Ⅲ)脅迫組SOD活性在第1～5天呈緩慢上升趨勢(shì)，在第7、8天迅速升高，第8天達(dá)到最大值(9.033 3±0.086 U·mg-1)； Sb(Ⅴ)脅迫組SOD活性也隨脅迫時(shí)間增加而升高，并在第1～5天增加較緩慢，而在第6～8天增加迅速，第8天時(shí)達(dá)到最大值(8.507 8±0.093 U·mg-1)。

圖4 Sb(Ⅲ)(左)和Sb(Ⅴ) (右)脅迫8 d后斜生柵藻結(jié)構(gòu)變化Fig.4 The superficial structure of S. obliquus stressed with different concentrations of Sb(Ⅲ) (left)and Sb(Ⅴ) (right) after 8 days

再次，隨著脅迫時(shí)間的延長，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理柵藻CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，并均在處理第5天達(dá)到最大值，而對(duì)照組基本在初始值附件上下波動(dòng)，且處理組大多數(shù)時(shí)間顯著高于同期對(duì)照(圖3,C)。其中，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理柵藻CAT活性在第5天時(shí)分別為(1.351 7±0.062)和 (1.339 8±0.062)U·mg-1，分別是同期對(duì)照組的2.34倍和2.33倍 (P<0.01)，它們?cè)诘?天時(shí)分別是對(duì)照組的2.23倍和1.68倍(P<0.01)。

2.4 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對(duì)斜生柵藻表面結(jié)構(gòu)的影響

柵藻表面結(jié)構(gòu)在100、200、400和800 μmol/L的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下的表現(xiàn)如圖4所示。在濃度為100 μmol/L的Sb(Ⅲ)脅迫下，能觀察到少量完整的柵藻細(xì)胞個(gè)體，其他藻體細(xì)胞周邊出現(xiàn)出大量的絮狀物，且隨著Sb(Ⅲ)濃度的增加?xùn)旁寮?xì)胞表面絮狀物不斷增多；在400 μmol/L Sb(Ⅲ)脅迫條件下，能清晰觀觀察到柵藻類細(xì)胞破損的情況；當(dāng)Sb(Ⅲ)濃度為800 μmol/L時(shí)，柵藻細(xì)胞出現(xiàn)大面積破損，在其表面附著大量絮狀物。同時(shí)，在100 μmol/L的Sb(Ⅴ)脅迫下，能清晰觀察到柵藻個(gè)體細(xì)胞及周邊的鞭毛，生長良好，與同濃度Sb(Ⅲ)脅迫處理的柵藻表面結(jié)構(gòu)相比，柵藻細(xì)胞數(shù)量更多、結(jié)構(gòu)更加完整；隨著Sb(Ⅴ)濃度的增加，柵藻細(xì)胞出現(xiàn)溶解破裂的情況?？梢?，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)不僅對(duì)柵藻細(xì)胞酶活性影響而且對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞。

3 討 論

自然環(huán)境中銻表現(xiàn)多種價(jià)態(tài)，但主要為Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)存在[17]，其價(jià)態(tài)與生物毒性關(guān)系密切[18]。本研究發(fā)現(xiàn)， Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)對(duì)斜生柵藻生長的影響表現(xiàn)在生物量、葉綠素a含量和表面結(jié)構(gòu)多個(gè)方面。首先，斜生柵藻生物量在Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下均表現(xiàn)出在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的Hormesis效應(yīng)[19]。相同濃度條件下，柵藻對(duì)Sb(Ⅲ)的脅迫響應(yīng)更加敏感，且隨著濃度的增加這一現(xiàn)象更加明顯，生物量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是由于Sb(Ⅲ) 毒性高于Sb(Ⅴ)[20]。李妍麗[21]、樊香絨等[22]對(duì)As(與Sb同一主族)毒性研究過程中也有相似的發(fā)現(xiàn)。其次，本研究中斜生柵藻葉綠素a含量在低濃度的Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下比對(duì)照組略有增加，由于低濃度Sb促進(jìn)柵藻細(xì)胞的生長，從而使得藻柵藻細(xì)胞生物量增加，葉綠素a含量隨之升高[23]。由于高濃度的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)破壞了藻類細(xì)胞的葉綠體[24]，其次抑制柵藻生長，葉綠素a含量隨之降低。同時(shí)還由于Sb(Ⅲ)毒性更強(qiáng)，從而表現(xiàn)出Sb(Ⅲ)對(duì)葉綠素a的影響大于Sb(Ⅴ)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫不僅會(huì)對(duì)柵藻膜的通透性產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，還造成細(xì)胞內(nèi)大量的無機(jī)鹽和有機(jī)物外滲，表現(xiàn)為細(xì)胞表面有大量絮狀物產(chǎn)生，一些細(xì)胞出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。這主要是由于在Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下柵藻細(xì)胞破裂后產(chǎn)生的碎片等與細(xì)胞粘結(jié)在一起所致[30]。但在相同的濃度下，Sb(Ⅲ)對(duì)柵藻細(xì)胞的破壞明顯大于Sb(Ⅴ)，從微觀層面佐證了Karadjova的結(jié)論[1]。

MDA為膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可以作為重金屬脅迫下藻類氧化壓力指標(biāo)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組藻類細(xì)胞由于生長環(huán)境改變，MDA含量略有增加，但隨時(shí)間增加?xùn)旁逯饾u適應(yīng)外部環(huán)境而MDA含量趨于平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)組中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫斜生柵藻MDA含量隨著脅迫時(shí)間增加而上升，表明藻細(xì)胞隨著Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫時(shí)間的增加細(xì)胞中活性氧化自由基逐漸升高，柵藻細(xì)胞受到不同程度的損傷。在Sb(Ⅲ)脅迫第8 d和Sb(Ⅴ)脅迫第6 d，斜生柵藻MDA含量均極顯著高于對(duì)照組。由于Sb(Ⅲ)比Sb(Ⅴ)有更強(qiáng)的毒性[1]，柵藻對(duì)Sb(Ⅲ)脅迫響應(yīng)更加明顯，而這種不利影響隨脅迫時(shí)間的增加而加強(qiáng)，并在第8天表現(xiàn)得尤為明顯。同時(shí)，柵藻在Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下會(huì)啟動(dòng)自身的清除活性氧的抗氧化防御系統(tǒng)[28]，產(chǎn)生抗氧化酶(SOD、CAT)，以維持柵藻細(xì)胞體內(nèi)活性氧代謝的相對(duì)穩(wěn)定。SOD對(duì)抵抗重金屬脅迫下柵藻產(chǎn)生的氧化自由基和維持柵藻體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[29]。在Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)實(shí)驗(yàn)組中，柵藻體內(nèi)SOD活性在脅迫處理第5～6天迅速增強(qiáng)，表示氧化自由基不斷增加[28]，在實(shí)驗(yàn)后期(第7～8天)，由于抗氧化體系抗氧化酶不能及時(shí)清除過量的氧自由基，SOD活性出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。CAT是生物體防護(hù)機(jī)制的中心酶，所有的脅迫都會(huì)誘導(dǎo)CAT活性增加。在本研究中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理柵藻CAT活性分別在第4、5 d顯著提高，明顯高于對(duì)照組，表明柵藻為應(yīng)對(duì)氧化壓力快速作出抗性反應(yīng)。但在高濃度和長時(shí)間的重金屬脅迫下藻類細(xì)胞的抗性逐漸減弱直到柵藻細(xì)胞死亡，這與劉璐、鄶安琪等研究銅綠微囊藻對(duì)鎘脅迫響應(yīng)的結(jié)果相一致[30-31]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中，低濃度、短時(shí)間Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)處理對(duì)斜生柵藻的生物量、葉綠素a含量有促進(jìn)作用；但隨著脅迫的濃度和時(shí)間不斷的增加， Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)對(duì)柵藻的生物量和葉綠素a含量產(chǎn)生抑制作用，且其細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損也隨著濃度的不斷增加而更加嚴(yán)重；斜生柵藻在不利的生長環(huán)境中，其自身會(huì)啟動(dòng)清除活性氧的抗氧化防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)增強(qiáng)自身抗氧化酶(SOD、CAT)活性，以維持柵藻細(xì)胞體內(nèi)活性氧代謝的相對(duì)穩(wěn)定。但是，由于斜生柵藻對(duì)Sb(Ⅲ) 和 Sb(Ⅴ)脅迫下的抗性過程十分復(fù)雜，所以今后將在植物分子蛋白和遺傳基因等方面探討其抗性機(jī)理，為深入研究重金屬脅迫下微藻的抗性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1] KARADJOVA I B, SLAVEYKOVA V I, TSALEV D L. The biouptake and toxicity of arsenic species on the green microalgaChlorellasalinain seawater[J].AquatToxicol, 2008,87(4): 264-271.

[2] FILELLA M, BELZILE N, CHEN Y,etal. Antimony in the environment: a review focused on natural waters. Ⅱ. Relevant solution chemistry[J].EarthSci.Rev., 2002, 59: 265-285.

[3] MCCALLUM R I. Occupational exposure to antimony compounds[J].JournalofEnvironmentalMonitoring, 2005,7(12): 1 245-1 250.

[4] 吳豐昌, 鄭 建, 潘響亮, 等. 銻的環(huán)境生物地球化學(xué)循環(huán)與效應(yīng)研究展望[J]. 地球科學(xué)進(jìn)展, 2008,23(4): 350-356.

WU F C, ZHENG J, PAN X L,etal. Prospect on biogeochemical cycle and environmental effect of antimony[J].AdvancesinEarthScience, 2008,(4): 350-356.

[5] 朱 靜, 吳豐昌, 鄧秋靜, 等. 湖南錫礦山周邊水體的環(huán)境特征[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009,29(3): 655-661.

ZHU J, WU F C, DENG Q J,etal. Environmental characteristics of water near the Xikuangshan antimony mine[J].ActaScientiaeCircumstantiae,2009,29: 655-661.

[6] 沈洛夫, 姜建國, 賴鳳英. 鹵代物對(duì)鹽藻的毒性試驗(yàn)及比較[J]. 四川環(huán)境, 2003,22(2): 17-18.

SHEN L F, JIANG J G, LAI F Y. Test of toxicity of halids toDunaliellasalina[J].SichuanEnvironment, 2003,22(2): 17-18.

[7] OMAR H H. Adsorption of zinc ions byScenedesmusobliquusandScenedesmusquadricaudaand its effect on growth and metabolism[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2002,50(2): 95-100.

[8] MAEDA S, OHKI A. Bioaccumulation and biotransformation of arsenic, antimony, and bismuth compounds by freshwater algae[M]// WANG Y S, TAM N F Y. Wastewater Treatment with Algae. Springer-Verlag and Landes Bioscience, 1998: 73-92.

[9] MAEDA S, FUKUYAMA H, YOKOYAMA E,etal. Bioaccumulation of antimony byChlorellavulgarisand the association mode of antimony in the cell[J].ApplOrganometallicchen, 1997, 11: 393-396.

[10] 歐陽崢嶸, 溫小斌, 耿亞紅, 等. 光照強(qiáng)度、溫度、pH、鹽度對(duì)小球藻(Chlorella)光合作用的影響[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2010,28(1): 49-55.

OUYANG Z R, WEN X B, GENG Y H,etal. The effects of light intensities, temperatures, pH and salinities on photosynthesis ofChlorella[J].PlantScienceJournal,2010,28(1): 49-55.

[11] 龔麗麗, 郭晶晶, 許曉明. Cr6+脅迫對(duì)萊茵衣藻光合作用的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2010,30(6): 1 166-1 172.

GONG L L, GUO J J, XU X M. Photosynthesis ofChlamydomonasreinhardtiiunder Cr6+stress[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2010,30(6): 1 166-1 172.

[12] ZHANG D, PAN X, MU G,etal. Toxic effects of antimony on photosystem II ofSynechocystissp. as probedbyinvivochlorophyll fluorescence[J].JournalofAppliedPhycology, 2010,22(4): 479-488.

[13] 胡芹芹, 熊 麗, 田裴秀子, 等. 鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對(duì)斜生柵藻的致毒效應(yīng)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2008,3(1): 87-92.

HU Q Q, XIONG L, TIAN F X Z,etal. Toxic effects of dibutyl phthalate(DBP) onScenedesmusobliquus[J].AsianJournalofEcotoxicology,2008,3(1): 87-92.

[14] 黃國蘭, 戴樹桂, 孫紅文, 等. 有機(jī)污染物對(duì)藻類毒性的測(cè)定[J]. 環(huán)境化學(xué), 1994, (3): 259-262.

HUANG G L, DAI S G, SUN H W,etal. Determination of the toxicity of organic pollutants to algae[J].EnvironmentalChemistry,1994,(3): 259-262.

[15] 呂 芳, 丁 剛, 王翔宇, 等. 鼠尾藻(Sargassumthunbergii)對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)脅迫的響應(yīng)[J]. 海洋與湖沼, 2017,48(2): 336-342.

Lü F, DIND G, WANG X Y,etal. Response ofSargassumthunbergllto the stress of dimethyl phthalate[J].OceanologiaEtLimnologiaSinica,2017,48(2): 336-342.

[16] 張 丹, 朱曉艷, 溫小斌, 等. 微藻培養(yǎng)基平衡pH的研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2014,38(3): 401-406.

ZHANG D, ZHU X Y, WEN X B,etal. Studies on equilibrim pH values of micro algal medium[J].ActaHydrobiologicaSinica,2014,38(3):401-406.

[17] AMARASIRIWARDENA D, WU F C. Antimony: Emerging toxic contaminant in the enviroent[J].MicrochemicalJournal, 2001,97(1): 1-3.

[18] SMICHOWSKI P. Antimony in the environment as a global pollutant: a review on analytical methodologies for its determination in atmospheric aerosols[J].Talanta, 2008,75(1): 2-14.

[19] CAKMAK I, HORST W J. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycinemax).[J].PhysiologiaPlantarum, 2006,83(3): 463-468.

[20] 陳秋平, 胥思勤, 安艷玲, 等. 銻礦區(qū)土壤As、Sb和Bi的污染與植物累積特征[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014,42(9): 236-240.

CHEN Q P, XUE S Q, AN Y L,etal. Soil As, Sb and Bi pollution and plant accumulation characteristics in Antimony Mine Area[J].GuizhouAgriculturalSciences,2014,42(9): 236-240.

[21] 樊香絨, 尹黎燕, 李 偉, 等. 不同價(jià)態(tài)砷對(duì)斜生柵藻生長及葉綠素?zé)晒獾挠绊慬J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2013,34(5): 60-64.

FAN X R, YI L Y, LI W,etal. Effect of arsenic species on the growth and chlorophyll fluorescence characteristics ofScenedesmusobliquus[J].JournalofHydroecology,2013,34(5): 60-64.

[22] 李妍麗, 柯 林. As(Ⅲ)和As(Ⅴ)對(duì)小球藻(Chlorellasp.)的生長影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2012,35(12): 61-64, 70.

LI Y L, KE L. Toxicity of arsenic species on growth of green microalgaeChlorellasp.[J].EnvironmentalScience&Technology,2012,35(12): 61-64, 70.

[23] 李建宏, 浩云濤, 翁永萍. Cd2+脅迫條件下橢圓小球藻的生理應(yīng)答[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2004,28(6): 659-663.

LI J H, HAO Y T, WEN Y P. Physical responses to Cd2+stress inChlorellaellipsoidea[J].ActaHydrobiologicaSinica,2004,28(6): 659-663.

[24] 馬廣岳, 施國新, 徐勤松, 等. Cr6+、Cr3+脅迫對(duì)黑藻生理生化影響的比較研究[J]. 廣西植物, 2004,24(2): 161-165.

MA G Y, SI G X, XU Q S,etal. Comparative studies of toxic effect of Cr6+, Cr3+stress on the physiological and biochemical characteristics ofHydrillaverticillata[J].Guihaia,2004,24(2):161-165.

[25] DISCHIA M, COSTANTINI C, PROTA G,etal. Lipofuscin-like pigments by autoxidation of polyunsaturated fatty acids in the presence of amine neurotransmitters: the role of malondialdehyde[J].BiochimicaetBiophysicaActa, 1996,1290(3): 319-326.

[26] 劉衛(wèi)華, 梁涌濤, 羅貴民, 等. 超氧化物歧化酶與過氧化氫酶的綴合物的制備與性質(zhì)研究[J]. 化學(xué)通報(bào), 1994, 12:36-39.

LIU W H, LIANG Y T, LUO G M,etal. Preparation and characterization of conjugates of superoxide dismutase and catalase[J].Chemistry,1994,12: 36-39.

[27] CAKMAK I, HORST W J. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycinemax)[J].PhysiologiaPlantarum, 1991,83(3): 463-468.

[28] 于 娟, 唐學(xué)璽, 張培玉, 等. CO2加富對(duì)兩種海洋微綠藻的生長、光合作用和抗氧化酶活性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào), 2005，25(2): 197-202.

YU J, TANG X X, ZHANG P Y,etal. Effects of CO2enrichment on growth, photosynthesis and activities of antioxidant enzymes of two marine micro-green-algae[J].ActaEcologicaSinica,2005,25(2): 197-202.

[29] 楊 洪, 黃志勇. 鋅脅迫對(duì)小球藻抗氧化酶和類金屬硫蛋白的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2012,32(22): 7 117-7 123.

YANG H, HUANG Z Y. Activities of antioxidant enzymes and Zn-MT-like proteins induced inChlorellavulgarisexposed to Zn2+[J].ActaEcologicaSinica,2012,32(22): 7 117-7 123.

[30] 劉 璐, 閆 浩, 夏文彤, 等. 鎘對(duì)銅綠微囊藻和斜生柵藻的毒性效應(yīng)[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(2): 478-484.

LIU L, YAN H, XIA W T,etal. Toxic effect of cadmium onMicrocysisaeruginosaandScenedesmusobliquus[J].ChinaEnvironmentalScience,2014,34(2): 478-484.

[31] 鄶安琪, 趙偉華, 李青云, 龍萌. 銅綠微囊藻對(duì)Cd2+脅迫的生理生化響應(yīng)[J]. 人民長江, 2016,47(16): 20-25.

[32] MICHALAK I, CHOJNACKA K, MARYCZ K. Using ICP-OES and SEM-EDX in biosorption studies[J].MicrochimicaActa, 2011,172(1/2): 65-74.