◎ 陳小玲 ，李新生 ，2，黨 婭 ，2，3，裴金金 ，2，韓 豪 ，2，李 雯 ，劉彩芬

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3.陜西省果業(yè)局藍莓研究所，陜西 漢中 723000）

藍莓又名越橘，杜鵑花科越橘屬植物。藍莓果風味獨特，具有較高的營養(yǎng)價值[1]。藍莓果酒因富含大量花青苷而具有很高的保健價值，深受人們關注與喜愛。但藍莓果酒的發(fā)酵過程容易造成花青苷流失，影響藍莓的營養(yǎng)和經濟價值[2]。目前，雖然已有研究對果酒的生產工藝進行優(yōu)化來達到改善果酒品質的目的，但少有人以花青苷為指標來改進藍莓果酒發(fā)酵工藝參數。因此，本研究將以不同發(fā)酵條件為背景，探究藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷的變化規(guī)律，為藍莓酒在生產加工中減少花青苷的損失提供一定的思路和參考，為藍莓果酒的工藝參數優(yōu)化提供理論依據[3]。將花青苷含量這一指標引入果酒釀造技術參數的篩選中具有一定的創(chuàng)新意義，它為藍莓果酒工藝參數優(yōu)化和品質控制提供了技術指導，搭建了理論平臺，對保證藍莓品質、提高農產品附加值、豐富我國果酒市場及確保人們身體健康具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

兔眼藍莓，采于陜西省果業(yè)管理局秦巴山區(qū)藍莓研究所藍莓試驗示范基地；安琪果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；2b1酵母菌、a2酵母菌，陜西理工大學食品發(fā)酵與工程實驗室。

1.1.2 試劑

花青苷標準品；果膠酶，上海藍季科技發(fā)展有限公司；碳酸鈣、偏重亞硫酸鉀，天津永盛精細化工有限公司；蔗糖、瓊脂粉、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；色譜純乙腈、色譜純甲醇，霍尼韋爾公司，色譜純甲酸，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52A旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；紫外分光光度計，（T6新世界）北京普析通用儀器有限責任公司；AUY120電子分析天平，島津公司；超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用儀，美國Waters公司；pH計。

1.3 藍莓果酒發(fā)酵工藝

實驗所采用的果酒發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1 藍莓果酒發(fā)酵工藝流程圖

①樣品處理：挑選個體完好的新鮮藍莓用榨汁機進行破碎、勻漿，使果肉破碎率達到90%以上。用紗布過濾，藍莓果汁制備樣品[4]。②酶解：加入果膠酶，將果汁置于60 ℃恒溫水浴鍋中2 h。③成分調整：以 蔗糖溶解調整果汁總糖，再用CaC03溶液調pH；加入0.01 g/L偏重亞硫酸鉀。④前發(fā)酵：從安琪葡萄酒干 酵母、釀酒酵母2b1釀酒酵母a2中挑選適合藍莓果汁發(fā)酵的酵母，加入不同實驗組進行發(fā)酵，持續(xù)發(fā)酵約10 d左右。⑤后發(fā)酵：控制樣品在相同條件下繼續(xù)發(fā)酵， 時間20 d左右。

1.4 花青苷含量測定方法

分別取不同時期不同實驗組的果酒樣品1 mL于離心管中，加入80%的乙醇溶液定容至10 mL，浸提6 h，4 000 r/min，20 ℃下離心10 min，后取上清液加入比色管中，用紫外分光光度計在530 nm處測出每個樣品中花青苷的吸光值，每組數據重復測3次，取平均值，繪制時間-花青苷吸光值曲線圖，得出藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量的變化規(guī)律[5]。

1.5 藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量變化規(guī)律

1.5.1 不同酵母菌對花青苷含量變化規(guī)律的影響

分別將a2酵母菌和2b1酵母菌、分離純化3次以上，并將其活化擴大培養(yǎng)24 h，之后分別接種到相同的藍莓果汁中，每隔兩天測1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值，記錄數據，得出發(fā)酵過程中對花青苷含量影響最小的酵母菌種，并將該酵母菌作為最優(yōu)酵母，在之后的實驗中均接種此酵母。

1.5.2 不同溫度對花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍莓汁于錐形瓶中，調整糖度為25°Bx，用CaC03調pH為3.3，加入0.01 g/L偏重亞硫酸鉀，接入5%的最優(yōu)酵母，分別控制發(fā)酵溫度在22、24、26、28、30 ℃，持續(xù)發(fā)酵l5 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.5.3 不同初始糖度對花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍莓汁于錐形瓶中，分別調整起始糖度含量分別為21、23、25、27、29°Bx，調pH為3.3，加入0.01 g/L偏重亞硫酸鐘，接入5%的最優(yōu)酵母，控制發(fā)酵溫度26 ℃，持續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.5.4 不同酵母添加量對花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍莓汁于錐形瓶中，調整糖分在25°Bx，用0.3%的果膠酶在60 ℃下酶解30 min，再用CaC03調pH為3.3，加入0.01 g/L偏重亞硫酸鉀，分別接入1%、3%、5%、7%、9%的最優(yōu)酵母持續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.5.5 不同果膠酶濃度對花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍莓汁于錐形瓶中，調整糖分在25°Bx，分別加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的果膠酶，于60 ℃下水浴加熱30 min，接入量為5%的最優(yōu)酵母，用CaC03調pH為3.3，控制發(fā)酵溫度26 ℃，持續(xù)發(fā)酵15 d，發(fā)酵過程中每隔兩天測1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值[6]。

1.5.6 不同初始pH對花青苷含量變化規(guī)律的影響

取200 mL新鮮藍莓汁于錐形瓶中，調整糖度為25°Bx，用0.3%的果膠酶在60 ℃下酶解60 min，再加入0.01 g/L偏重亞硫酸鐘，用CaC03分別調整pH為3.1、3.3、3.5、3.7、4.9。接入5%的最優(yōu)酵母，在26 ℃下連續(xù)發(fā)酵15 d。發(fā)酵過程中每隔兩天測1次發(fā)酵液中花青苷的吸光值。

1.6 藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷種類的變化規(guī)律

采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用儀測定藍莓果酒中花青苷的種類[7]。

1.6.1 質譜方法的建立

離子源，電噴霧離子源（ESI）；檢測模式，多反應監(jiān)測；掃描方式，正離子掃描；脫溶劑氣流量，800 L/h；錐孔氣流量，50 L/h；毛細管電壓，3 kV；離子源溫度，110 ℃；脫溶劑氣溫度，400 ℃[8]。

1.6.2 色譜條件

色譜柱，ACQUITYUPLC HSS C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速 0.3 mL/min；柱溫 40 ℃；進樣量 10 μL。流動相A為乙腈，B為0.6%甲酸水溶液，進行梯度洗脫，梯度洗脫參數見表1。

表1 超高效液相色譜條件表

1.6.3 樣品的制備

果汁樣：取100 mL新鮮藍莓汁于旋轉蒸發(fā)儀中，35 ℃下蒸發(fā)至水分揮干，4 000 r/min，離心5 min后倒出上清液，再用6%甲酸溶液定容至100 mL容量瓶中，取2 mL樣品用微孔過濾膜（黃色）過濾后放在小瓶子里，進樣測定。

果酒樣：分別取不同時期的果酒100 mL于旋轉蒸發(fā)儀中，揮干酒精和水分，4 000 r/min，離心5 min后倒出上清液，再6%甲酸溶液定容至100 mL容量瓶中，取2 mL樣品用微孔過濾膜（黃色）過濾后放在小瓶子里，進樣測定，與對照組進行比對，分析討論藍莓果汁在發(fā)酵過程中花青苷種類的變化，得出結論。

2 結果與討論

2.1 藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量的變化規(guī)律

2.1.1 不同酵母種類下花青苷含量的變化規(guī)律

由圖2可知，3個菌種發(fā)酵的藍莓果酒中花青苷含量都呈下降趨勢，其中a2酵母菌的穩(wěn)定性比2b1和安琪的好，對果酒發(fā)酵過程中花青苷的影響較小，且有利于發(fā)酵后期花青苷的保留，所以a2酵母菌確定為藍莓果酒發(fā)酵最適酵母菌，之后進行的實驗均接種該酵母。

圖2 不同酵母種類下花青苷含量的變化規(guī)律圖

2.1.2 不同溫度下花青苷含量變化規(guī)律

溫度是影響酵母生長、繁殖與發(fā)酵的主要環(huán)境因素，酵母只能在一定的溫度范圍內才能生長并起發(fā)酵作用[9]。如圖3所示，5個溫度梯度下，花青苷的含量都呈下降趨勢，第8～12 d時，5個溫度梯度樣品中花青苷含量都大幅下降。24 ℃時花青苷的下降趨勢緩慢且最終保留量高于其他幾個溫度梯度，為最適發(fā)酵溫度；30 ℃下花青苷含量下降最快，可能是由于溫度越高，花青苷越不穩(wěn)定，越容易分解，導致花青苷損失。

圖3 不同溫度對花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.3 不同初始糖度下花青苷含量變化規(guī)律

糖是酵母菌生長繁殖的能量來源，起始糖度對果酒發(fā)酵產生重要的影響。從圖4可以看出，糖度對花青苷的影響程度較小，5個不同糖度梯度樣品花青苷變化曲線的離散程度較小，變化規(guī)律幾乎一致且都呈下降趨勢，第8 d后花青苷的含量下降加快。初始糖度過大反而抑制了酵母的生長和發(fā)酵，發(fā)酵緩慢導致產生酒精較慢，而適當的糖度反而可以加快酒精的產生，有利于更多花青苷的溶解，25°Bx下花青苷的保留率大于其他，為最適糖度。

圖4 不同糖度對花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.4 不同酵母添加量下花青苷含量變化規(guī)律

菌種是保證發(fā)酵順利進行的重要保證，如圖5所示，添加9%的酵母，在發(fā)酵的前4 d，由于發(fā)酵產生酒精，所以花青苷的含量較多，但第4 d后，花青苷的含量急劇減少，且最終保留率低，可能是因為接種量過大，導致酵母細胞繁殖過快，消耗大量糖分，不利于酒精的積累；而接種量過小，如添加1%的酵母，則導致發(fā)酵時間延長，前期花青苷含量不高，后期含量趨于穩(wěn)定，且總體呈下降趨勢。從圖5中看出，5%的酵母是最適添加量。

圖5 不同酵母量對花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.5 不同果膠酶濃度下花青苷含量變化規(guī)律

藍莓中含有豐富的果膠物質，會導致澄清困難、出汁率低等問題。試驗表明，果膠酶的添加量對藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷含量的影響幾乎成正比，在標準范圍內，果膠酶添加量越多則溶出的花青苷越多。但整個過程花青苷含量依然呈現下降趨勢。如圖6所示，在發(fā)酵第2～6 d有小幅度的上升，可能是因為酶解使更多的花青苷溶出，酶添加量越多，花青苷溶出越多，考慮到成本問題，選擇0.5%為最適加酶量。

圖6 不同果膠酶濃度對花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.1.6 不同初始pH下花青苷含量變化規(guī)律

在適宜微酸性環(huán)境下，酵母菌生長、繁殖和發(fā)酵都很迅速，且花青苷在pH 2～4是最穩(wěn)定的[10]，如圖7所示，pH越高，越不利于花青苷的保留，pH 3.3時，花青苷保留率相對較高，但總體仍呈下降趨勢，隨著微生物對發(fā)酵液的降解，發(fā)酵液的pH會發(fā)生變化，在第8～14 d時，花青苷含量大幅下降。

圖7 不同pH對花青苷變化規(guī)律的影響圖

2.2 藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷種類的變化規(guī)律

通過超高效液相色譜柱對初始藍莓汁樣品進行分離，并用PDA檢測器在530 nm處進行測定，色譜圖中主要的峰有11個，可得藍莓中主要的花青苷類物質為11種，其中保留時間分別為：2.58、2.85、3.10、3.41、3.52、3.65、3.79、4.05、4.38、4.61、4.93 min。如圖8 所示。

圖8 超高效液相色譜圖

通過UPLC/MS-MS對藍莓果酒樣品進行全掃描，并用PDA檢測器在530 nm處進行測定，可得藍莓中主要花青苷類物質有11種，其中保留時間分別為：2.63、2.87、3.13、3.44、3.55、3.69、3.81、4.09、4.41、4.69、4.96 min。將色譜圖和質譜全掃描圖譜對比可初步鑒定藍莓果酒中也有11種花青苷類化合物，如圖9所示。因此，在藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷種類基本不變。

圖9 UPLC/MS-MS全掃描圖

3 結論

在藍莓果酒發(fā)酵前20 d里，花青苷的變化規(guī)律如下：藍莓果酒發(fā)酵過程中花青苷的種類基本不變，含量總體呈下降趨勢；在發(fā)酵第2～6 d，花青苷含量略有上升，可能是發(fā)酵產生的酒精對花青苷進一步的溶解，之后花青苷含量則一直呈下降趨勢，其中第8～12 d下降速度最快。在不同的發(fā)酵工藝中，對花青苷含量變化規(guī)律影響程度大小順序為：溫度＞果膠酶濃度＞酵母添加量＞pH＞初始糖度。其中，在溫度為26 ℃、pH 3.3、酵母添加量為5%時，花青苷的保留率較高，為最適發(fā)酵條件；果膠酶的濃度對花青苷的影響幾乎成正比，考慮成本問題，則選取濃度為0.5%，更有利于花青苷的保留；糖度過大或者過小都不利于酒精積累，從而降低花青苷的溶解，其中25°Bx為最適條件。

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