盧雯瑩 趙磊 李天奇 崔鶴云 廖平安

（1. 漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，漯河 462000；2. 中國科學(xué)院武漢植物園，武漢 430074；3. 漯河市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，漯河 462000）

薔薇科植物是自然界的重要組成部分，世界上許多水果，如蘋果、梨、草莓和桃等均屬于薔薇科植物。薔薇科果實因富含花青苷而具有豐富多彩的顏色?；ㄇ嘬兆鳛橐环N重要的抗氧化酚類化合物，具有預(yù)防心血管疾病、抗炎抗癌活性，是重要的保健物質(zhì)［1］。近年來，消費者對水果保健功能的要求越來越高，如何提高水果的花青苷含量是果樹學(xué)家長期研究的課題。

不同于糖酸代謝，花青苷是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，代謝起始物質(zhì)為葡萄糖分解產(chǎn)生的苯丙氨酸?；ㄇ嘬盏纳锖铣赏緩揭咽智逦?，研究表明，光照和溫度等外界環(huán)境、乙烯和茉莉酸等激素水平均能調(diào)節(jié)花青苷代謝，從而影響果實的花青苷含量。隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的提高，科學(xué)家們對花青苷積累的的分子機理進行了探索，這些機理將為提高薔薇科果實花青苷含量奠定堅實的理論基礎(chǔ)。為此，本文對近些年來有關(guān)薔薇科果實花青苷積累的分子調(diào)控機理研究進行了綜述。

1 花青苷生物合成及轉(zhuǎn)運途徑

植物之所以顯示顏色，主要是富含葉綠素、類胡蘿卜素、甜菜素和黃酮類等物質(zhì)，花青苷作為黃酮類的重要組成，對園藝作物果實色澤有著重要的影響［2-3］。20世紀初，Weldon［4］對孟德爾關(guān)于豌豆著色的研究進行了總結(jié)，自此，花青苷生物合成途徑被不斷完善?；谇叭藢τ衩?、金魚草和矮牽?；ㄉ蛔凅w的研究，Holton等［5］第一次詳細總結(jié)了植物花青苷生物合成途徑?；ㄇ嘬蘸铣善鹗加诒奖彼岽x產(chǎn)生的香豆素-輔酶A和乙酸代謝途徑產(chǎn)生丙二酰-輔酶A，在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的催化下，1分子香豆素-輔酶A和3分子的丙二酰-輔酶A形成4-羥基查爾酮，經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）催化，4-羥基查爾酮生成柚苷配基，在黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃烷酮-3'-羥化酶（Flavonoid 3'-hydroxylase，F(xiàn)3'H）和黃烷酮-3'，5'-羥化酶（Flavonoid 3'，5'-hydroxylase，F(xiàn)3'5'H）催化下，柚苷配基產(chǎn)生矢車菊色素和飛燕草色素，經(jīng)二氫黃酮醇-4-還原酶（Dihydroflavone alcohol-4-reductase，DFR）還原成無色花青素，再經(jīng)無色花色素雙加氧酶或花青素合成酶（Leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX或ANS）催化產(chǎn)生顯色花青素，在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Flavonoid/anthocyanidin 3GT，UFGT）的作用下，完成糖基化修飾，生成各種花青苷。最后，O-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMTs）完成甲基化修飾，產(chǎn)生錦葵色素、芍藥色素和矮牽牛色素等最終產(chǎn)物［6-11］。植物中花青苷的生物合成十分保守。近幾十年來，隨著分子生物學(xué)的興起，花青苷生物合成途徑基因在薔薇科果實中也不斷被克隆。使用軟件Clustalx和網(wǎng)站BoxShade（https：//embnet.vitalit.ch/software/BOX_form.html），對花青苷生物合成途徑關(guān)鍵基因CHS、DFR和UFGT在擬南芥及常見薔薇科不同種屬部分物種（表1）間進行蛋白多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個基因蛋白序列都較為保守；CHS、DFR這2個基因的蛋白序列在擬南芥中存在明顯的分化，但在薔薇科果實中十分保守（圖1-A、1-B）；相較于CHS、DFR而言，雖然UFGT序列上存在差異，但其蛋白相似性依然較高（圖1-C）。盡管在薔薇科不同種屬果樹中都找到了控制花青苷生物合成的基因，但由于基因表達以及拷貝數(shù)不同，造成了不同果實積累的花青苷種類和含量存在差異。

表1 常見薔薇科植物種屬信息

細胞質(zhì)中形成的花青苷轉(zhuǎn)移到細胞液泡中進行儲存。液泡內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境使花青苷免于降解而顯示多種顏色。近年來，科學(xué)家們在研究如何提高花青苷生物合成途徑基因表達量的同時，也關(guān)注花青苷液泡轉(zhuǎn)運對于果實積累花青苷的決定性影響。目前，在薔薇科果實花青苷轉(zhuǎn)運方面，主要集中在對多藥與毒性化合物排出轉(zhuǎn)運蛋白（Multidrug and toxic compound extrusion，MATE）和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase，GST）轉(zhuǎn)運體的研究。薔薇科不同種屬果實中GST轉(zhuǎn)運蛋白序列相對保守（圖2）。Gomez等［12］通過對葡萄轉(zhuǎn)基因毛狀根花青苷自發(fā)熒光的分析，揭示了MATE對參與以小囊泡為介質(zhì)，轉(zhuǎn)移花青苷到液泡這個過程中所起的關(guān)鍵作用，而GST轉(zhuǎn)運體則可能通過直接結(jié)合花青苷的方式完成液泡轉(zhuǎn)運。GST對花青苷轉(zhuǎn)運的重要影響先后在草莓、蘋果、梨、桃等果實上得到證實［13-16］。薔薇科不同種屬果實中GST轉(zhuǎn)運蛋白序列相對保守（圖2）。

2 調(diào)節(jié)基因?qū)ㄇ嘬辗e累的影響

植物花青苷生物合成基因的表達受MYB-bHLHWD40，即MBW復(fù)合體的調(diào)控，作用機制相對保守。MBW復(fù)合體是由MYB轉(zhuǎn)錄因子（蛋白序列含一至多個MYB結(jié)構(gòu)域）、bHLH轉(zhuǎn)錄因子（蛋白具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)）和WD40蛋白（蛋白由40個左右的氨基酸殘基組成，具有保守WD序列）特異互作形成（即MYB與bHLH直接互作，bHLH與WD40直接互作，這種互作在蘋果果實中得到驗證［17］）。對模式植物擬南芥花青苷形成的調(diào)控機理研究表明，AtMYB11/12/111等MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青苷生物合成的早期基因AtCHS、AtCHI、AtF3H和AtF3'H有激活表達的作用，后期合成基因AtDFR、AtLDOX、AtUFGT的表達受AtMYB75/90/113/114等形成的MBW復(fù)合體進行調(diào)控［18-19］。由此可見，MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青苷生物合成基因的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。MYB轉(zhuǎn)錄因子由于其結(jié)構(gòu)域數(shù)量的差異，功能而有所不同。目前在薔薇科果實花青苷研究領(lǐng)域，主要集中在對R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究。

圖1 主要薔薇科植物CHS（A）、DFR（B）和UFGT（C）蛋白多序列比較

圖2 主要薔薇科植物GST轉(zhuǎn)運蛋白多序列比較

在不同蘋果品種中分離得到MdMYB1、MdMYB10、MdMYBA這3個高度同源的R2R3類型MYB基因，MdMYB1和MdMYBA對蘋果果皮著色起關(guān)鍵作用［20-21］，而蘋果果肉著色主要受MdMYB10調(diào)控［22］。另外，對蘋果果實外源施加茉莉酸后，MdMYB9和MdMYB11表達量升高，二者可與MdLDOX、MdANR和MdLAR的啟動子結(jié)合，促進花青苷和原花青苷的生物合成［23］。MdMYB24L被激活表達并作用于MdUFGT啟動子上，促進花青苷積累［24］。與擬南芥同源的MdMYB3能激活MdCHS、MdCHI、MdUFGT、MdFLS等基因的表達，促進包括花青苷在內(nèi)的眾多黃酮類物質(zhì)積累［25］。蘋果MdMYB308L受冷害誘導(dǎo)表達，協(xié)同MdbHLH33增強與MdCBF2和MdDFR啟動子的結(jié)合，促進蘋果果實著色［26］。

從沙梨（Pyrus pyrifolia）和西洋梨（Pyrus communis）果實中克隆得到的PyMYB10和PcMYB10兩個R2R3類型基因［27-28］對花青苷積累起著決定性作用。Feng等［29-30］通過全基因分析，從不同沙梨品種中克隆了另外2個促進花青苷積累的R2R3類型MYB轉(zhuǎn)錄因子：PyMYB10.1和PyMYB70。PyMYB10.1的作用模式和PyMYB10相同，通過與PybHLH形成復(fù)合體，激活花青苷生物合成基因表達。庫爾勒香梨（Pyrus bretschneideri Rehd）PbMYB10b和PbMYB9通過激活PbDFR和PbUFGT的表達，促進花青苷生物合成［31］。梨果實著色的原因則是位于5號連鎖群的PyMYB114與PyERF3、PybHLH3形成復(fù)合體，共同激活下游靶基因的結(jié)果［32］。

對花青苷生物合成起關(guān)鍵作用的R2R3類型MYB轉(zhuǎn)錄因子，在其他薔薇科果實中也逐漸被報道發(fā)現(xiàn)。草莓FaMYB10、中國李PcMYB10.6、桃PpMYB10.1、甜櫻桃PavMYBA和PavMYB10.1、杏PaMYB10等基因已被證實對果實的花青苷積累有重要作用［33-38］。在不同品種桃果實中，位于3號染色體串聯(lián)重復(fù)的PpMYB10.1、PpMYB10.2、PpMYB10.3基因表達存在差異，其中，PpMYB10.1對桃果實花青苷生物合成起著最為關(guān)鍵的作用［10，34，39］。MYB轉(zhuǎn)錄因子除了有促進花青苷生物合成的作用外，一些還具有抑制花青苷積累的作用。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，R2R3類型MYB轉(zhuǎn)錄因子中AtMYB4/6/7/32抑制花青苷合成。目前對薔薇科果實花青苷抑制型轉(zhuǎn)錄因子的研究，同樣集中在R2R3類型MYB轉(zhuǎn)錄因子，如草莓FaMYB1（從Fragaria×ananassa克隆得到）和FcMYB1（從Fragaria chiloensis克隆得到）、桃PpMYB18、蘋 果MdMYB16和MdMYB15L、梨PbMYB120等［40-45］。這些R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子大多數(shù)是由于其蛋白C端存在EAR 抑制基序，且與激活型MYB競爭性結(jié)合bHLH轉(zhuǎn)錄因子，從而減弱花青苷生物合成基因的表達，抑制果實著色。

MYB轉(zhuǎn)錄因子除了可以直接激活花青苷生物合成基因表達外，還能直接促進花青苷轉(zhuǎn)運蛋白的表達，促進花青苷的液泡轉(zhuǎn)運。從草莓誘變產(chǎn)生的白色品種YW5AF7中克隆得到的FaMYB10轉(zhuǎn)錄因子雖然能直接促進FaGST的表達，但由于FaGST編碼的蛋白提前終止使得花青苷無法正常轉(zhuǎn)運至液泡中，從而導(dǎo)致白色性狀產(chǎn)生［13］。蘋果中重要的花青苷轉(zhuǎn)運蛋白MdGSTF6受MdMYB1調(diào)控表達，直接影響花青苷的液泡積累［14］。

使用軟件Clustalx和MEGA6.0，對調(diào)節(jié)花青苷生物合成基因MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建 Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹，結(jié)果圖3所示，綠色和紅色覆蓋區(qū)域分別代表促進型和抑制型MYB轉(zhuǎn)錄因子。這些MYB明顯分成兩大組：其中由綠色線條組成的區(qū)域與擬南芥AtMYB75/90/113/114親緣關(guān)系較近，是其同源基因的促進型MYB轉(zhuǎn)錄因子；紅色線條組成的區(qū)域中既包含AtMYB4/6/7/32、FcMYB1、PpMYB18和MdMYB16等在內(nèi)的抑制型MYB轉(zhuǎn)錄因子，也包含AtMYB11/12/111、MdMYB3、MdMYB9和PbMYB9等在內(nèi)的促進型MYB轉(zhuǎn)錄因子，系統(tǒng)進化關(guān)系較為復(fù)雜。

3 外界環(huán)境因素對果實著色的研究

植物感受外界環(huán)境變化會產(chǎn)生一系列的代謝反應(yīng)。光照和溫度等外界環(huán)境的刺激能引起薔薇科果實花青苷積累發(fā)生顯著變化。光照對花青苷積累的影響主要由光強和光質(zhì)2個因素決定，蘋果果實在黑暗環(huán)境下，細胞核內(nèi)的E3泛素連接酶MdCOP1蛋白介導(dǎo)在花青苷積累過程中起重要作用的MdMYB1轉(zhuǎn)錄因子的降解［46］。光照能夠激活細胞內(nèi)多條信號通路，促進果實花青苷積累：首先，黑暗條件下，COP1會泛素化降解MdMYB1，光照刺激下，光受體（紅光受體PhyA/B，藍光受體CRY1/2、紫外受體UVR8）會競爭MdMYB1與COP1互作，有效避免MdMYB1降解而穩(wěn)定存在于細胞核內(nèi)；其次，光照能夠誘導(dǎo)表達光信號途徑重要轉(zhuǎn)錄因子MdHY5，并直接結(jié)合MdMYB10啟動子E/G-box元件，促進MdMYB10基因表達［47］；另外，光照條件會激活MdBBXs表達。MdBBX1能增強MdMYB10行使其激活花青苷生物合成基因表達的功能［48］，MdBBX37與MdMYB1互作后負調(diào)控果實著色［49］；高光誘導(dǎo)表達MdTCP46蛋白與MdMYB1轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，增強MdMYB1對下游靶基因的激活能力［50］；光照促進MLNC3.2 和 MLNC4.6 這2個lncRNA（長鏈非編碼RNA）的表達，介導(dǎo)miR156a對花青苷的調(diào)節(jié)［51］。梨PyMYB10基因啟動子區(qū)域存在光響應(yīng)元件，其表達量隨光照直接發(fā)生變化［27］，光照同時刺激PyBBX16表達，協(xié)同PyHY5轉(zhuǎn)錄因子共同激活PyMYB10的表達［52］。二倍體草莓品種“Ruegen”（Fragaria vesca）的果實在光照刺激后，被激活表達的FvbHLH9和FvHY5形成二聚體并結(jié)合在下游靶基因FvDFR啟動子上，促進果實花青苷的生物合成［53］。

光質(zhì)對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要，不同光質(zhì)對果實花青苷積累影響存在差異。Tao等［54］通過比較不同光質(zhì)對“紅早酥”梨果實著色的影響發(fā)現(xiàn)，紅光對花青苷的影響小，藍光則能明顯促進果實著色。Ni等［55］證實在藍光條件下，上調(diào)表達的Py4ERF24和Py12ERF96轉(zhuǎn)錄因子與PyMYB114互作，共同增強對下游靶基因PyUFGT的激活作用，促進梨果實花青苷積累。藍光能激活草莓花青苷生物合成途徑基因表達，促進果實著色［56］。Zhao等［57］發(fā)現(xiàn)桃果實對不同的紫外線響應(yīng)存在品種差異性，紫外線激活PpHYH（HY5 Homolog）、PpGST等蛋白的表達，促進桃果實花青苷積累。紫外線處理促進蘋果果實花青苷積累至少存在兩條途徑：MdBBX20和MdBBX22表達升高，協(xié)同MdHY5增強對下游靶基因MdMYB10、MdCHS的激活［58-59］；表達升高的MdWRKY72結(jié)合MdHY5和MdMYB1基因啟動子W-box元件，促進果實著色［60］。

溫度會顯著影響薔薇科果樹花青苷的積累，并對花青苷的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。低溫處理能促進蘋果果實花青苷的積累。一方面，低溫脅迫增強了MdbHLH3表達，促進其對下游靶基因MdDFR、MdUFGT和MdMYB1的激活［61］；另一方面，MdMYB308L激活表達后協(xié)同MdbHLH33增強與MdCBF2和MdDFR啟動子結(jié)合［26］；低溫還能誘導(dǎo)MdBBX20表達，與MdHY5形成二聚體共同激活MdMYB10、MdCHS的表達［59］。高溫降低了調(diào)節(jié)蘋果花青苷形成的MBW復(fù)合體多種組分的轉(zhuǎn)錄水平［62］。溫度條件對草莓果實著色也有顯著影響：低溫能夠促進FaMYB10、降低FaMYB1的表達，從而促進花青苷積累，高溫影響花青苷的穩(wěn)定性［63-64］。

圖3 主要薔薇科植物MYB調(diào)節(jié)基因系統(tǒng)進化關(guān)系

除了光照和溫度能影響薔薇科果實花青苷積累外，干旱脅迫、外源氮等處理等在一定程度上也能影響果實著色。干旱條件下，蘋果MdERF38激活表達，協(xié)調(diào)MdMYB1促進花青苷生物合成［65］。外源氮處理促進蘋果氮響應(yīng)蛋白MdBT2表達并介導(dǎo)MdMYB1泛素化降解［66］。CO2處理草莓果實能下調(diào)花青苷生物合成基因表達，抑制采后著色［67］。

4 激素物質(zhì)對花青苷積累影響的研究

植物激素是一些微量而能調(diào)節(jié)自身生理過程的有機化合物。激素對植物的生長發(fā)育有重要的調(diào)控作用。薔薇科果實花青苷積累受植物激素乙烯（Ethylene，ETH）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、脫落酸（Abscisic acid，ABA）、生長素（Auxin）等信號通路的影響。

乙烯影響植物成熟衰老，是果實產(chǎn)生的最重要激素之一。乙烯促進薔薇科蘋果、李等果實著色［68-70］。外源添加乙烯處理的蘋果果實，乙烯信號通路中MdEIL1和MdERF1B激活表達，直接提高MdMYB1和MdMYB9、MdMYB11等轉(zhuǎn)錄因子的表達量，促進果實花青苷積累［69-70］。乙烯對果實花青苷積累具有多重性。研究表明，梨果實施加乙烯處理后，PyMYB10、PyMYB114等轉(zhuǎn)錄因子被抑制表達，花青苷積累過程受阻［71］。

茉莉酸影響花青苷積累主要是通過其信號通路重要因子：JAZ蛋白發(fā)揮作用的。在擬南芥中，JAZ蛋白與調(diào)控花青苷生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子互作，影響了MBW復(fù)合體的功能，抑制花青苷生物合成［72］。在蘋果中，茉莉酸可以通過不同的JAZ蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。MdJAZ2可通過結(jié)合MdbHLH3進而抑制后者與MdMYB9、MdMYB11的結(jié)合作用，因此減弱MdMYB9、MdMYB112個轉(zhuǎn)錄因子對MdUFGT的激活［23］；MdJAZ8、MdJAZ11可以靶向MdMYC2（bHLH轉(zhuǎn)錄因子），抑制MdMYC2與MdMYB24L結(jié)合，從而抑制MdMYB24L對MdUFGT的轉(zhuǎn)錄［24］。在外源施加JA后，JAZ蛋白被泛素途徑降解，從而促進蘋果花青苷生物合成基因的表達。同樣，梨果實外源添加JA處理后，上調(diào)表達的PbERF22增強了PbMYB10對下游PbUFGT的轉(zhuǎn)錄活性，促使梨果實著色［73］。

脫落酸促進薔薇科果實蘋果、甜櫻桃等花青苷積累［36，74］，蘋果MdZIP44受脫落酸誘導(dǎo)表達，協(xié)同MdMYB1增強蘋果果實花青苷生物合成［74］。生長素影響草莓、紅樹莓和蘋果等薔薇科果實著色［75-77］。對蘋果研究表明，生長素通過“MdIAA121-MdARF13”模塊介導(dǎo)對花青苷的積累［77］。赤霉素通過其信號通路中不同的酶發(fā)揮調(diào)節(jié)花青苷積累的作用。模式植物擬南芥赤霉素抑制活性酶AtGA2ox1以依賴AtHY5、AtHYH的方式，參與低溫誘導(dǎo)花青苷的過程［78］。在梨果實中，赤霉素途徑酶PbGA2ox8能誘導(dǎo)果皮花青苷積累，使果皮呈現(xiàn)條狀紅色［79］。此外，細胞分裂素和油菜素甾醇對薔薇科果實花青苷積累也有報道。細胞分裂素處理蘋果果實，MdMYB10基因上調(diào)表達，抑制因子MdMYBL2下調(diào)表達，共同促進蘋果果實花青苷積累［80-81］。油菜素甾醇處理能上調(diào)表達蘋果果實花青苷生物合成途徑及關(guān)鍵MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，促進果實花青苷積累［82］。

5 小結(jié)

花青苷作為一種重要的抗氧化劑，對薔薇科植物果實著色起著至關(guān)重要的影響。如何提高果實的花青苷含量既是消費者提出的現(xiàn)實要求，也是果樹學(xué)家們研究的重點方向。在薔薇科植物不同果實中，花青苷生物合成基因及花青苷轉(zhuǎn)運基因相對保守，其功能也大致相同，但調(diào)節(jié)機制存在差異。目前，在薔薇科植物不同果實中均克隆得到AtMYB75/90/113/114的同源MYB基因（圖3，綠色線條分支），這些MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)花青苷生物合成作用機制基本相同。但在蘋果、梨等果實中還發(fā)現(xiàn)了其他MYB轉(zhuǎn)錄因子，如蘋果MdMYB9、MdMYB11、MdMYB308L和梨PyMYB70、PyMYB114等促進型MYB轉(zhuǎn)錄因子及MdMYB15L、MdMYB16和PbMYB120等抑制型MYB轉(zhuǎn)錄因子，這表明MYB基因在不同物種中各自分化，在不同的外界或激素響應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，發(fā)掘不同果實中的MYB調(diào)節(jié)因子仍是關(guān)鍵。

薔薇科植物果實花青苷積累調(diào)節(jié)機制存在差異，不同果實對外界環(huán)境或激素處理的響應(yīng)不同：蘋果、草莓等果實著色必須依賴于光照，而桃果實花青苷積累可以不依靠光照，產(chǎn)生“近核紅”這一現(xiàn)象；乙烯處理促進蘋果、草莓等果實其著色，而抑制梨果實花青苷生成。對于如何提高果實花青苷生成，以往的研究往往集中于某單一因素，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子和激素信號通路可以聯(lián)系在一起。如提高碳供給能介導(dǎo)赤霉素、茉莉酸、細胞分裂素和脫落酸等激素信號關(guān)鍵因子對果實花青苷的促進作用［83-86］。這些研究結(jié)果表明，外界環(huán)境因素可以直接或間接影響薔薇科果樹激素代謝水品，從而影響著色。也就是說，對果實采取多因素協(xié)調(diào)控制，可以更好地促進果實著色。