馬旺 丁濱 丁秦超 王萃 任宣奇 竇曉兵★

酒精性肝?。ˋLD）是由于長期過度飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，近年來我國ALD的發(fā)病率及病死率也呈現(xiàn)逐年增長趨勢，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。4-羥基壬烯酸（4-HNE）是肝臟長期暴露于酒精后產(chǎn)生的一種肝細(xì)胞致敏因子，其對(duì)肝臟蛋白的修飾會(huì)促進(jìn)ALD的形成，在ALD 的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［1］。近年來研究證實(shí)，H2S以4-HNE為靶點(diǎn)具有治療多種疾病的潛質(zhì)［2-3］。但是H2S和4-HNE 的相關(guān)研究在肝病中未見報(bào)道。本研究旨在證明是否可以通過補(bǔ)充外源H2S，進(jìn)而通過清除4-HNE，從而抑制肝細(xì)胞死亡。在本研究中以人的肝癌細(xì)胞系HepG2為細(xì)胞模型，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)，通過MTT法﹑LDH活性檢測﹑ELISA以及Western Blot技術(shù)探究H2S對(duì)4-HNE誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的抑制作用及分子機(jī)制，為在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平闡明ALD的發(fā)生發(fā)展過程提供新的思路，為ALD的臨床治療提供新的策略，也為以4-HNE為靶點(diǎn)的新型藥物的研發(fā)提供重要的理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞HepG2購自中科院上海細(xì)胞庫。試劑：4-HNE購自Cayman Chemical公司；β-Actin 抗體購自武漢博士德公司；4-HNE抗體購自R&D公司；H2S檢測試劑盒購自上海橋杜生物有限公司；LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Thermo scientific；其他實(shí)驗(yàn)試劑均購自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)及分組：人肝細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清﹑青霉素100 U/ml﹑鏈霉素100 mg/L的DMEM培養(yǎng)液于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制備人肝癌細(xì)胞HepG2單細(xì)胞懸液，細(xì)胞按2×105個(gè)/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，分成4組：①空白對(duì)照組（UT）：不作任何藥物處理；②4-HNE組：單加20μmol/L 4-HNE處理；③NaHS組：單加0.4mmol/L的NaHS處理；④4-HNE+NaHS組：NaHS預(yù)處理2h后再加入4-HNE處理。以上四組每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，均處理18h。（2）細(xì)胞增殖測定（MTT法）：將上述細(xì)胞按2×105個(gè)/ml密度制備單細(xì)胞懸液，每孔200μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組重復(fù)6孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行藥物孵育。再加入20μl MTT溶液在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔中所有培養(yǎng)液，各孔加入150μl DMSO，于搖床上振蕩10min待紫色結(jié)晶充分溶解后在酶標(biāo)儀490nm波長處測定并記錄吸光度值A(chǔ)490。（3）乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測：根據(jù)LDH檢測試劑盒說明測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平，分析各組間的藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。（4）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測細(xì)胞內(nèi)H2S水平：細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)后用液氮反復(fù)凍融及RIPA裂解液裂解從而使得細(xì)胞內(nèi)H2S釋放出來，根據(jù)ELISA試劑盒（上海橋杜生物公司）說明書操作，經(jīng)包被，樣本孵育，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，終止等步驟檢測細(xì)胞內(nèi)H2S水平。（5）蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）檢測蛋白表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)及藥物孵育后，PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入含有PMSF﹑Na3VO4﹑NaF﹑蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，置冰上裂解≥30min，4℃下以12000r/min離心10 min后取上清液，用BCA試劑盒測定提取液中的蛋白質(zhì)濃度。將各組調(diào)整至同一水平后，以20μg上樣量備樣，經(jīng)SDSPAGE電泳﹑轉(zhuǎn)移電泳﹑封閉﹑抗體免疫﹑顯影﹑曝光等步驟檢測蛋白表達(dá)情況（以β-actin做內(nèi)參對(duì)照）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源NaHS（H2S前體）能升高肝細(xì)胞內(nèi)H2S水平 利用H2S ELISA試劑盒檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)H2S水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4-HNE單獨(dú)作用HepG2肝細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)H2S水平與對(duì)照組比較明顯降低（P＜0.05），若先用0.4mmol/L的NaHS預(yù)處理HepG2肝細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)H2S水平顯著升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 外源NaHS（H2S前體）能升高肝細(xì)胞內(nèi)H2S水平

2.2 外源NaHS（H2S前體）顯著抑制4-HNE誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡 通過MTT法檢測的結(jié)果顯示，隨著4-HNE濃度升高，其對(duì)細(xì)胞殺傷作用顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖2A。用不同濃度NaHS預(yù)處理HepG2細(xì)胞后結(jié)果顯示，隨著NaHS濃度升高，其細(xì)胞活性比單獨(dú)4-HNE處理組明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見圖2B。LDH活性檢測結(jié)果表明，用4-HNE單獨(dú)作用HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活性與對(duì)照組比較明顯降低（P＜0.05），若先用0.4 mmol/L的 NaHS預(yù)處理HepG2細(xì)胞后，其細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05），見圖2C。

2.3 升高肝細(xì)胞內(nèi)H2S水平可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物水平 利用Western Blot技術(shù)檢測肝細(xì)胞內(nèi)4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物水平。結(jié)果表明，20μmol/L的4-HNE作用于HepG2肝細(xì)胞之后，細(xì)胞內(nèi)4-HNE蛋白質(zhì)加合物表達(dá)增加。用0.4 mmol/L NaHS預(yù)處理肝細(xì)胞2h后，再加入20 μmol/L的4-HNE孵育1 h，與4-HNE單獨(dú)作用組比較，NaHS+4-HNE組細(xì)胞內(nèi)4-HNE蛋白質(zhì)加合物水平顯著降低，見圖3A和3B。

圖2 補(bǔ)充NaHS（H2S前體）顯著抑制4-HNE誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡。A：不同濃度4-HNE對(duì)HepG2肝細(xì)胞增殖的影響。（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 20 μmol/L 4-HNE）；B：不同濃度NaHS對(duì)HepG2肝細(xì)胞增殖影響（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 4-HNE）

圖3 升高肝細(xì)胞內(nèi)H2S水平可以顯著降低胞內(nèi)4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物水平。A： 4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物水平；B： 4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物水平的條帶灰度值統(tǒng)計(jì)（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 4-HNE）

3 討論

肝臟是酒精代謝的主要人體器官，長期的酒精攝入會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，4-羥基壬烯酸（4-HNE）是酒精誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物之一，在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。長期大量飲酒可以導(dǎo)致肝臟活性氧族（ROS）增多，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，生成的4-HNE通過與細(xì)胞內(nèi)的核酸或蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合形成加合物，改變肝細(xì)胞生理狀態(tài)和功能，進(jìn)而誘發(fā)ALD。1997年，Paradis V等［4］首次報(bào)道慢性酒精性肝病患者體內(nèi)的4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物的濃度明顯高于正常人。其后臨床研究﹑流行病學(xué)調(diào)查及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，酒精性肝病患者及長期酗酒人群的肝臟及血漿中的4-HNE濃度顯著升高，其與蛋白質(zhì)形成的加合物的濃度可能與ALD的嚴(yán)重程度相關(guān)［5-6］。上述研究結(jié)果表明，4-HNE是ALD發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)重要的致病因素，然而對(duì)于4-HNE如何誘導(dǎo)或加重ALD及其具體機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。Sampey BP等［7］的研究證明4-HNE可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)的ERK﹑Akt等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡。而4-HNE是否還可以通過對(duì)蛋白質(zhì)的表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控其他細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引發(fā)或加劇酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞死亡尚未見明確報(bào)道。

而H2S參與了多種與4-HNE相關(guān)疾病的防治。Zheng-Wei L等［8］發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性H2S的合成可以增加活性氧以及氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物的產(chǎn)生，而機(jī)體補(bǔ)充外源性的H2S則可以降低活性氧以及氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物的產(chǎn)生，并具有一定的抗氧化應(yīng)激作用。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充H2S前體NaHS后可檢測到肝細(xì)胞內(nèi)H2S水平顯著升高。MTT法和LDH活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2S可以抑制4-HNE誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡。由此，推測外源H2S可以抑制肝細(xì)胞死亡，然而H2S是否通過清除4-HNE來抑制肝細(xì)胞凋亡從而改善ALD尚不可知。

據(jù)報(bào)道，正常人血漿中4-HNE的生理濃度為0.3～0.7μmol/L，而ALD患者的血漿中4-HNE濃度顯著增加，肝臟的局部細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，4-HNE濃度甚至可高達(dá)100μmol/L［9］。如何降低過量的4-HNE水平，使其恢復(fù)至正常水平，保持4-HNE在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡是防治ALD的關(guān)鍵。4-HNE與蛋白質(zhì)結(jié)合形成4-HNE蛋白質(zhì)加合物是4-HNE發(fā)揮病理作用的主要機(jī)制之一，本研究Western blot結(jié)果顯示，4-HNE與蛋白質(zhì)結(jié)合并不是某一特定分子量的條帶，而是從15～200KDa之間均會(huì)形成4-HNE與蛋白質(zhì)的加合物，故目前來看，4-HNE與蛋白質(zhì)的結(jié)合并不是特定的，而是與細(xì)胞內(nèi)的蛋白廣泛結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。為觀察外源H2S對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)4-HNE蛋白質(zhì)加合物表達(dá)的影響，用0.4mmol/L H2S前體NaHS預(yù)處理肝細(xì)胞2h，再加入20μmol/L的4-HNE孵育1h后提取蛋白后進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示4-HNE作用后細(xì)胞內(nèi)4-HNE蛋白質(zhì)加合物表達(dá)明顯增強(qiáng)，而H2S可顯著抑制其增加。

綜上所述，長期攝入酒精引起肝細(xì)胞內(nèi)4-HNE水平升高，而H2S的前體NaHS可以提高肝細(xì)胞內(nèi)H2S水平，清除4-HNE與蛋白質(zhì)形成的加合物，從而抑制4-HNE誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡。這將為ALD的臨床治療提供新的策略，也為以4-HNE為靶點(diǎn)的新型藥物研發(fā)提供重要的理論指導(dǎo)和依據(jù)。然而，H2S清除肝細(xì)胞內(nèi)4-HNE的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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