唐 笑，黃 凱，楊淇齡，羅志遠(yuǎn)，武林華，左 騰

( 1.廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530000； 2.河池市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西 河池 547000 )

肉堿是動物體內(nèi)常見含氮非蛋白質(zhì)類小分子，對其生長發(fā)育、繁殖等方面有重要的功能，已被應(yīng)用于機(jī)能性食品添加劑、飼料添加劑及藥品領(lǐng)域。畜牧業(yè)的快速發(fā)展，如何合成安全、方便和高效的促生長劑成為藥物及營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，L-肉堿使用方便，在飼料中添加L-肉堿具有提高水產(chǎn)動物生長、抗脂肪肝、提升魚肉品質(zhì)和減輕殺蟲劑、藥物、氨等毒性物質(zhì)對水產(chǎn)動物的毒害作用等效果，肉堿作為一種新型的飼料添加劑在多行業(yè)進(jìn)行了研究利用[2]。因而，建立檢測肉堿的準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好的高效液相色譜法迫切而有實際意義。

目前國內(nèi)外應(yīng)用高效液相色譜法檢測肉堿的報道不多，其他較為先進(jìn)的檢測方法有：色譜法[3-5]、生物法[6]、化學(xué)比色法[7]、酶法[8]、光譜法[9]、熒光法[10]、放射酶分析法[11]和酮戊二酸脫氫酶法[12]。但肉堿極性強(qiáng)、紫外吸收弱，筆者根據(jù)其理化性質(zhì)，采用對溴苯乙酰基溴紫外衍生法來降低極性，能增加檢測的靈敏度，同時結(jié)合正相色譜分離技術(shù)，建立測定羅非魚血漿中肉堿含量的柱前衍生—正相高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與試驗魚

UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)、精密電子天平、高速臺式離心機(jī)、Vortex-Genie 2型漩渦混合器、HW-100型恒溫水浴箱、5200DT型超聲清洗機(jī)。

肉堿標(biāo)準(zhǔn)品、魚旺四號、甲醇、乙腈、異丙醇、三乙胺、三乙醇胺、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氧化銀、對溴苯乙?；?、10%和40%四丁基氫氧化銨、肝素鈉、10 mmol/L的肉堿儲備液、50 μmmol/L肉堿工作液。

選取體質(zhì)量為(82.71±1.28) g的吉富羅非魚(Oreochromisniloticus, GIFT)。試驗前3 d停止投喂飼料。試驗在玻璃水族箱中進(jìn)行，水溫(28±1) ℃，pH 6.9±0.1，持續(xù)保持充氣狀態(tài)。

1.2 正向色譜的基本條件

色譜柱：Kromasil Sil 色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相配制：用電子天平稱取檸檬酸(C6H8O7·H2O)1.89 g，加入約400 mL超純水溶解，定容至500 mL以配置檸檬酸緩沖液。乙腈—檸檬酸緩沖液(90∶10，體積比)，其中每升流動相中含有0.25 mL三乙胺，在上機(jī)前流動相及樣品均用0.45 μm 濾膜減壓過濾，流速1.2 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長260 nm，進(jìn)樣量20 μL[13-14]。

1.3 色譜條件的優(yōu)化方案

1.3.1 樣品的處理方法

處理方法1：取標(biāo)準(zhǔn)品0.3 mL溶液至離心管，加入乙腈∶甲醇(9∶1，體積比) 1 mL，混勻后加入400 mg的磷酸氫二鈉+氧化銀混合物(9∶1，質(zhì)量比)和400 mg的磷酸二氫鉀，漩渦振蕩5 min，離心5 min，用移液槍移取上清液900 μL，再次加入NaH2PO4∶Ag2O (9∶1，體積比) 混合物及KH2PO4各250 mg，漩渦振蕩2 min后靜置 20 min，10 000 r/min 離心10 min。取上清液600 μL, 加入衍生劑10%四丁基氫氧化銨50 μL，混勻后70 ℃水浴 90 min，取出流水冷卻后吸取20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。

處理方法2：前面步驟同方法1，將磷酸二氫鉀換成無水磷酸二氫鉀后，立即劇烈振搖5 min，8000 r/min離心5 min，取上清液600 μL，后面步驟同方法1。

1.3.2 流動相的選擇

試驗考察了每1000 mL流動相中三乙胺含量(0.10、0.20、0.25、0.30、0.35 mL)對試驗結(jié)果的影響。

1.3.3 柱溫的選擇

在柱溫分別為25、30、35 ℃時進(jìn)樣，考察其柱溫變化對衍生后的肉堿衍生物分離效果的影響。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用超純水稀釋肉堿儲備液至1、5、25、50、100、200、400 μmol/L，按制樣方法各步驟進(jìn)行處理后測定，重復(fù)3次。經(jīng)高效液相色譜法分析后得到峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)相關(guān)系數(shù)估計樣本中肉堿的定量的線性范圍。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理方法對肉堿衍生物色譜峰的影響

結(jié)果顯示，兩種樣品處理方法對肉堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的影響差異顯著，處理方法2相對于處理方法1操作更簡便，縮短樣品處理時間，但兩者對出峰時間影響較小。另外，相同濃度肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，按方法2處理制備樣品，肉堿提取量增加，肉堿與衍生試劑反應(yīng)更完全，峰面積增大，肉堿衍生物色譜峰峰形良好，不受其他雜質(zhì)干擾峰的干擾。因此，采用方法2處理樣品來進(jìn)行后續(xù)試驗。兩種方法制備出的肉堿衍生物色譜圖見圖1。

圖1 不同處理方法對肉堿衍生物色譜峰的影響a：方法1處理；b：方法2處理

2.2 流動相的選擇

結(jié)果顯示，在流動相中添加三乙胺可延長肉堿衍生物在色譜柱上的保留時間(圖2)，但色譜柱壓上升，過高的三乙胺會損壞色譜柱。本試驗選擇的流動相為乙腈—檸檬酸緩沖液(90∶10，體積比), 其中每升流動相中含有三乙胺0.25 mL。

2.2.3 柱溫的選擇

柱溫的變化對分離效果無顯著影響，肉堿衍生物的出峰時間隨著柱溫的升高而保留時間縮短，25、30、35 ℃時肉堿保留時間分別為11.213、11.113、11.073 min，為縮短檢測樣品的時間，確定本試驗的檢測柱溫為35 ℃(圖3～圖5)。

3 方法學(xué)上的驗證

3.1 專屬性試驗

按上述條件進(jìn)行測定，肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間約為11.03 min，血清樣品肉堿衍生物的保留時間為11.82 min。肉堿衍生物與內(nèi)存性物質(zhì)分離完全，無雜峰干擾。約15 min內(nèi)可完成一次進(jìn)樣分析。肉堿標(biāo)準(zhǔn)品及羅非魚血清樣品色譜圖見圖6和圖7。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

在1～400 μmol/L濃度線性范圍內(nèi)，肉堿衍生物色譜峰面積與待測樣品的濃度呈良好的線性關(guān)系(圖8)。

圖2 流動相三乙胺含量對肉堿衍生物保留時間的影響

圖3 柱溫為25 ℃時肉堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖4 柱溫為30 ℃時肉堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖5 柱溫為35 ℃時肉堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖6 肉堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖7 羅非魚血清樣品色譜

圖8 肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 最低檢測限

配置不同濃度的肉堿樣品，測得在本試驗色譜條件下L-肉堿的最低檢測限為1 μmol/L。

3.4 精密度

配制不同濃度的L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(1、25、100、400 μmol/L)按照本試驗確定的樣品方法處理之后，測定肉堿的日內(nèi)、日間精密度，其結(jié)果見表1。

由表1可知，肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的日內(nèi)變異系數(shù)為1.79%～5.56%，日間變異系數(shù)為9.83%～11.81%。

3.5 回收率

配制不同濃度(1、25、100、200 μmol/L)羅非魚血清樣品，測定肉堿回收率。結(jié)果顯示，羅非魚混合空白血清樣品中肉堿含量為(2.10±0.34) μmol/L，測定回收率為88.16%～101.48%，平均回收率95.83%(表2)。

3.6 樣品穩(wěn)定性

將濃度為50 μmol/L的肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法制樣，置于室溫下(25～30 ℃)，在衍生反應(yīng)完成后每隔3 h測一次，重復(fù)3次，連續(xù)測定12 h以觀其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，肉堿衍生物在反應(yīng)12 h內(nèi)穩(wěn)定，12 h峰面積變化相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.58%，符合檢測要求。

表1 肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的日內(nèi)、日間精密度(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6)

表2 不同濃度肉堿的相對回收率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5)

表3 12 h內(nèi)肉堿穩(wěn)定性的測定

3.7 樣品分析

自尾靜脈抽取羅非魚血液，4000 r/min離心15 min，分離血漿。測定血清中游離肉堿水平為(2.10±0.34) μmol/L。

4 討 論

4.1 L-肉堿的檢測方法選擇

目前，關(guān)于測定血液中游離肉堿測定方法中較為實用的是酶法[15]、放射同位素酶法[16]、質(zhì)譜法[17-18]。酶法測定過程復(fù)雜，樣品測定時間較長，且檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與酶活性及共存物等因素關(guān)聯(lián)較大；放射同位素酶法相對于酶法較靈敏，但測定方法精密度較差，其測定過程仍復(fù)雜，且有損傷操作者和污染環(huán)境的缺點(diǎn)；質(zhì)譜法儀器成本高，測定過程復(fù)雜，故質(zhì)譜法雖有良好的精密度和準(zhǔn)確度卻無法大規(guī)模的推廣應(yīng)用。采用正相液相色譜法時發(fā)現(xiàn)，保留時間延長，出峰時間約為11.1 min，肉堿衍生物與其他物質(zhì)分離完全，峰型良好。孫慶寶等[19]將肉堿衍生化反應(yīng)后，以二氧化硅為固定相，在乙腈—檸檬酸緩沖液為流動相，260 nm波長的色譜條件下定量檢測兔血清游離肉堿的含量。肉堿衍生物的出峰時間約為12.5 min，峰形清晰對稱，與樣品中其余內(nèi)源性物質(zhì)分離完全。但其處理樣品時間長，操作相對繁瑣。肉堿的結(jié)構(gòu)式為β-羥-γ-三甲氨基丁酸，肉堿極性較強(qiáng)，在用反相色譜法測定肉堿時，可通過加入離子對試劑庚烷磺酸鈉溶劑[20]、辛烷磺酸鈉溶液[21]可使色譜柱中對L-肉堿保留時間延長，加入離子對試劑的缺點(diǎn)是其對色譜柱具有吸附作用，長期使用對色譜柱損害較大，另外柱子的平衡和沖洗時間長?？紤]到以上情況，本試驗采用柱前衍生正向色譜法，通過加入具有強(qiáng)紫外吸收的衍生試劑，與肉堿反應(yīng)后生成對紫外吸收敏感的酯化物，從而達(dá)到降低肉堿極性，增加其紫外吸收。流動相中檸檬酸濃度的改變對于肉堿衍生物分離度影響較小，但過高濃度的三乙胺會對色譜柱造成損傷[19]。所以相比較而言，在流動相中加入純水稀釋檸檬酸是更優(yōu)選擇，對色譜柱影響較小。肉堿中含有活性基團(tuán)，即羥基和羧基，故常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛[22]、芴甲氧羰酰氯[1]、9-氰酸蒽、L-丙氨酸-β-萘胺[23]、4-溴苯酰三氟甲烷磺胺[24]、對溴苯乙酰基溴[25]等。選用對溴苯乙酰基溴作為衍生試劑，它是一種芳香族試劑，其與肉堿的羧基發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定、適用范圍廣泛。

4.2 HPLC法測定血漿樣品影響因素分析

檢測在血漿L-肉堿的應(yīng)用中，應(yīng)注意：(1)凍融因素。本試驗的血漿L-肉堿的日內(nèi)變異系數(shù)為1.79%～5.56%，達(dá)到了血清檢測變異系數(shù)需<10%的要求[26]，日間變異系數(shù)為9.83%～11.81%，未達(dá)到檢測要求。趙亞明等[27]研究人體血漿L-肉堿的日內(nèi)變異系數(shù)均<5%，而日間變異系數(shù)>10%，與本試驗結(jié)果相似。推測原因可能是血樣采用-20 ℃冷凍保存，在每次試驗前需要解凍，導(dǎo)致精密度下降。為避免以上情況發(fā)生，建議測定L-肉堿樣品時盡量用新鮮血樣。(2)水分因素。肉堿衍生化反應(yīng)須在無水情況下進(jìn)行[28]，對所用試劑、血漿中的水分均須去除完全，否則將影響到衍生化反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。(3)混合均勻度因素。血漿中的氯離子和水分對試驗衍生物的分離度有較大的干擾，故須將衍生化試劑與肉堿充分的混合以試劑中的銀離子能與血漿中的氯離子充分作用達(dá)到去除血漿中的氯離子的作用，同時，充分的混合可去除血漿中的水分，提高肉堿衍生物的產(chǎn)率。據(jù)文獻(xiàn)報道，在處理樣品時通過振搖1 h的方法以保證反應(yīng)能充分完全[29]。本試驗則采用在漩渦振蕩儀上漩渦振蕩5 min，試驗結(jié)果表明這種方法也能達(dá)到同樣的效果，且縮短了樣品的處理時間。

本試驗通過考察流動相、柱溫對色譜峰的影響和樣品處理方法等方面，建立了相應(yīng)的高效液相色譜法。該方法具有良好的專屬性，肉堿衍生物與內(nèi)存性物質(zhì)分離完全。且重復(fù)性、線性關(guān)系、精密度均達(dá)到要求，最低檢測度為1 μmol/L也達(dá)到了要求，肉堿衍生物在反應(yīng)12 h內(nèi)穩(wěn)定說明試驗穩(wěn)定性良好，故可將其作為檢測L-肉堿的分析方法。

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