韓耀全,何安尤,藍(lán)家湖,吳偉軍,李育森,王大鵬,雷建軍,施 軍

( 1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院,廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530021；2.廣西都安瑤族自治縣水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局,廣西 都安 530700 )

烏原鯉(Procyprismerus)俗名烏鯉、烏鉤、黑鯉、墨鯉等，屬鯉形目、鯉科、鯉亞科、原鯉屬，是珠江水系特有魚(yú)類，僅分布于珠江流域西江水域部分干流及支流[1-2]。由于眾多致危因素導(dǎo)致其自然資源日漸枯竭，已列為《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》瀕危物種和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》易危物種[3]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于烏原鯉的研究極少，僅見(jiàn)有烏原鯉精子活力的影響[4]和寄生于烏原鯉鰓指環(huán)蟲(chóng)(Dactylogyrus)新種等[5]少量報(bào)道。近年來(lái)烏原鯉的資源保護(hù)工作受到重視，魚(yú)類培育及繁殖工作已陸續(xù)開(kāi)展，但有關(guān)烏原鯉生理生化、遺傳學(xué)和人工繁殖及養(yǎng)殖增殖的研究成果少有公開(kāi)發(fā)表報(bào)道。為了開(kāi)展烏原鯉資源養(yǎng)護(hù)與增殖，筆者自2014年起展開(kāi)了烏原鯉性腺發(fā)育及人工繁殖相關(guān)技術(shù)研究，2016年3月成功人工繁育出烏原鯉仔魚(yú)3批次。全程觀察烏原鯉胚胎發(fā)育過(guò)程，為烏原鯉資源保護(hù)增殖工作和相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)催產(chǎn)、人工授精與孵化

烏原鯉親本來(lái)自漁民捕獲出售的成熟親魚(yú)及野生魚(yú)苗池塘培育成熟的親魚(yú)，雌親魚(yú)體質(zhì)量1.0～2.0 kg，雄親魚(yú)體質(zhì)量0.8～2.5 kg。2016年3月8日、10日和26日，3次進(jìn)行烏原鯉人工催產(chǎn)及胚胎發(fā)育觀察。篩選性腺發(fā)育良好的親魚(yú)，按每千克體質(zhì)量對(duì)雌魚(yú)注射催產(chǎn)，催產(chǎn)藥物為：1 mg鯉魚(yú)腦垂體+20 μg促黃體素釋放激素類似物+3 mg馬來(lái)酸地歐酮，用0.9%氯化鈉注射液研磨、溶解約至每尾魚(yú)1 mL劑量。采取胸鰭基部1次性注射，注射后放入催產(chǎn)池中，流水刺激促產(chǎn)。試驗(yàn)雄魚(yú)性腺發(fā)育良好，未注射催產(chǎn)藥物。待發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)池中親魚(yú)出現(xiàn)追逐，有產(chǎn)卵跡象時(shí)進(jìn)行人工干法授精。受精卵置于微流水、連續(xù)充氧孵化桶中孵化，水溫為(20±1) ℃和(15±1) ℃、溶解氧>7 mg/L。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

參考魚(yú)類胚胎發(fā)育相關(guān)研究成果，描述烏原鯉胚胎各個(gè)發(fā)育階段不同時(shí)期的發(fā)育特征[6-12]。通過(guò)OLYMPUS CX31生物顯微鏡和OLYMPUS SZ61體視顯微鏡對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行連續(xù)活體觀察，利用OLYMPUS DP73顯微鏡成像系統(tǒng)和OLYMPUS cellSens Standard 1.6顯微鏡圖像程序?qū)Ω靼l(fā)育時(shí)期胚胎進(jìn)行成像和采集。受精后至囊胚期前每隔10 min、囊胚期后至原腸晚期每30 min、原腸晚期后每60 min觀察拍攝記錄1次。隨機(jī)取樣20粒以上，觀察，拍攝，記錄各發(fā)育階段的形態(tài)特征及發(fā)育時(shí)間，以50%胚胎進(jìn)入某個(gè)發(fā)育階段為該發(fā)育階段的起始時(shí)間，自前一個(gè)發(fā)育階段至下一個(gè)發(fā)育階段的時(shí)間間隔為該階段的持續(xù)發(fā)育時(shí)長(zhǎng)。發(fā)育積溫為某發(fā)育期平均水溫與此發(fā)育期持續(xù)發(fā)育時(shí)長(zhǎng)的乘積。

為清晰觀察及拍攝胚胎發(fā)育圖像，并觀察經(jīng)去膜處理胚胎的發(fā)育情況，試驗(yàn)同步觀察未處理及經(jīng)去膜處理胚胎的發(fā)育情況。烏原鯉卵膜不易通過(guò)物理方法剝離，采用Solarbio胰蛋白酶0.1%、0.25%、0.35%水解液對(duì)受精卵進(jìn)行消化，消化3～10 min，消化時(shí)間達(dá)到后用Holtfreter培養(yǎng)液清洗并在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育，直至出膜。Holtfreter培養(yǎng)液為3.5 g NaCl+0.05 g KCl+0.1 g CaCl2+0.2 g NaHCO3溶解至1000 mL雙蒸水中配制而成。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

受精卵卵徑、胚胎及出膜仔魚(yú)等相關(guān)長(zhǎng)度數(shù)據(jù)使用OLYMPUS DP73顯微鏡成像系統(tǒng)和OLYMPUS cellSens Standard 1.6顯微鏡圖像軟件內(nèi)置測(cè)量程序采集及測(cè)量。選取3次試驗(yàn)觀察拍攝獲得的典型照片通過(guò)Adobe Photoshop CS 8.0.1軟件處理后，作為各烏原鯉胚胎各發(fā)育階段的特征模版照片。

2 結(jié) 果

烏原鯉約4齡性成熟，為一次性產(chǎn)卵型魚(yú)類[13]，產(chǎn)卵期2—4月。成熟卵子呈圓球形，亮黃色，卵徑1.68～1.98 mm，具較強(qiáng)黏性。受精卵吸水膨脹后，卵徑2.28～2.57 mm。烏原鯉胚胎發(fā)育與其他魚(yú)類胚胎發(fā)育過(guò)程相似，歷經(jīng)受精、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成及孵化出膜6階段，每個(gè)發(fā)育階段又有若干個(gè)發(fā)育時(shí)期[9-19]。在水溫(20±1) ℃、溶解氧>7.0 mg/L條件下，烏原鯉受精至出膜時(shí)長(zhǎng)為80.8 h，胚胎發(fā)育所需總積溫為1616.0 ℃·h。

受精卵階段：受精后1.50 h，胚盤(pán)隆起。本階段歷時(shí)2.22 h，積溫44.4 ℃·h。

卵裂階段：受精后2.22、3.07、3.93、4.82、5.90 h和7.13 h，分別進(jìn)入2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、32細(xì)胞期和多細(xì)胞期。本階段2.22～9.02 h，歷時(shí)6.80 h，積溫136.0 ℃·h。

囊胚階段：受精后9.02、10.42、12.17 h，分別進(jìn)入囊胚早期、囊胚中期和囊胚晚期。本階段9.02～15.37 h，歷時(shí)6.35 h，積溫127.0 ℃·h。

原腸胚階段：受精后15.37、19.25、21.27 h，分別進(jìn)入原腸早期、原腸中期和原腸晚期。本階段15.37～21.88 h，歷時(shí)6.51 h，積溫130.2 ℃·h。

神經(jīng)胚階段：受精后21.88、22.47 h，分別進(jìn)入神經(jīng)胚期和胚孔封閉期。本階段21.88～24.63 h，歷時(shí)2.75，積溫55.0 ℃·h。

器官形成階段：受精后24.63 h肌節(jié)出現(xiàn)，26.42、28.55、30.85、31.77 h，眼基、眼囊、尾芽和尾鰭相繼形成，34.97 h眼晶體出現(xiàn)，37.73 h進(jìn)入肌肉效應(yīng)期，40.37 h耳石出現(xiàn)，43.53心臟形成，52.38 h進(jìn)入心臟搏動(dòng)期。本階段24.63～80.80 h，歷時(shí)56.17 h，積溫1123.4 ℃·h。

孵化出膜階段：受精后80.80 h，仔魚(yú)孵化出膜。本階段歷時(shí)47.45 h。其中初始出膜時(shí)間為71.33 h，25%出膜時(shí)間為78.60 h， 50%出膜時(shí)間80.80 h， 75%出膜時(shí)間為87.72 h，最遲出膜時(shí)間為128.25 h；水溫(15±1) ℃時(shí)，烏原鯉受精卵至出膜時(shí)長(zhǎng)為116.5 h，初始出膜時(shí)間為100.50 h，25%出膜時(shí)間為110.33 h，50%出膜時(shí)間為116.50 h，75%出膜時(shí)間為134.33 h，最遲出膜時(shí)間為164.50 h。

初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)約6100 μm，體高1600 μm。卵黃囊呈前大后小漏斗形，后部約為前部最高的1/5～1/4。出膜后靜臥水底，偶能掙扎彈起，不能游動(dòng)；出膜24 h仔魚(yú)全長(zhǎng)6500 μm，體高1640 μm。卵黃囊前大后小，后部高約為前部最高的1/3；出膜48 h仔魚(yú)全長(zhǎng)7240 μm，體高1540 μm；出膜72 h仔魚(yú)全長(zhǎng)7970 μm，體高1390 μm。靜臥水底，可偶爾彈起游動(dòng)數(shù)秒。水溫(20±1) ℃條件下烏原鯉胚胎發(fā)育過(guò)程各個(gè)發(fā)育時(shí)期主要特征見(jiàn)表1和圖1。

3 討 論

3.1 烏原鯉胚胎發(fā)育特點(diǎn)

烏原鯉隸屬的鯉科鯉亞科共有5屬魚(yú)類，分別為鲃鯉屬(Puntioplites)、原鯉屬(Procypris)、鯉屬(Cyprinus)、須鯽屬(Carassioides)和鯽屬(Carassius)[1-2]，原鯉屬、鯉屬和鯽屬魚(yú)類有胚胎發(fā)育研究記載[14-18]，鲃鯉屬和須鯽屬尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。烏原鯉胚胎發(fā)育過(guò)程與相同亞科魚(yú)類相似，但不同魚(yú)類胚胎各發(fā)育時(shí)間及歷時(shí)各有特點(diǎn)[14-18]。水溫約20 ℃時(shí)，原鯉屬的烏原鯉胚胎發(fā)育時(shí)長(zhǎng)80.80 h，巖原鯉(P.rabaudi)90.57 h。鯉屬的三角鯉(C.multitaeniata)為92.17 h，相差不大。鯉屬的鯉魚(yú)(C.carpio)胚胎發(fā)育時(shí)長(zhǎng)為60.00 h，鯽屬的鯽魚(yú)(C.anratus)為59.08 h，時(shí)間較短。

烏原鯉與同屬的巖原鯉相比，受精卵階段至囊胚階段發(fā)育時(shí)間基本相近，原腸胚階段至器官形成階段，巖原鯉胚胎發(fā)育相對(duì)較慢；水溫約20 ℃時(shí)，烏原鯉出膜階段持續(xù)時(shí)長(zhǎng)47.45 h，比巖原鯉的27.43 h更長(zhǎng)，二者均為尾部先出膜；烏原鯉與巖原鯉胚胎心臟搏動(dòng)時(shí)間及各時(shí)期心率略有差異，巖原鯉受精后65.25 h心臟開(kāi)始搏動(dòng)，65.75 h心率38次/min，78.27 h(即開(kāi)始搏動(dòng)13 h后)心率60次/min，初孵仔魚(yú)心率80～82次/min。烏原鯉受精后50.78 h心臟開(kāi)始搏動(dòng)，55.67 h心率40～45次/min，55.68～67.67 h心率60次/min，開(kāi)始搏動(dòng)17 h后，心率穩(wěn)定在75次/min。

烏原鯉胸鰭原基出現(xiàn)較早，在尾鰭形成期已經(jīng)出現(xiàn)。巖原鯉胸鰭原基在心臟原基形成階段才形成[14]。

表1 烏原鯉胚胎發(fā)育特征

(續(xù)表1)

發(fā)育階段發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)間/h發(fā)育階段持續(xù)時(shí)間/h主要形態(tài)特征圖解器官形成階段晶體形成期34.97肌肉效應(yīng)期37.73嗅窩耳石期40.37心臟形成期43.53心臟摶動(dòng)期52.38脊索非常清晰,眼杯中可見(jiàn)晶體,卵黃體呈上腎形,肌節(jié)清晰。1v胚體延長(zhǎng),頭部突出,尾的邊緣出現(xiàn)皮褶,可見(jiàn)胚體微弱的間歇性顫動(dòng),顫動(dòng)時(shí)間間隔及次數(shù)無(wú)規(guī)律。此時(shí)去膜胚胎直徑1594 μm,高2489 μm。頭尾間距718 μm。眼長(zhǎng)305 μm,眼高268 μm,眼晶體直徑117 μm。1w眼囊逐漸凹陷呈杯狀,脊索前端的上方出現(xiàn)小泡狀耳囊,尾鰭伸長(zhǎng),脊索可見(jiàn),肌肉收縮加強(qiáng),眼前方有一對(duì)淺的凹陷,耳囊出現(xiàn)小石粒。尾鰭長(zhǎng)550 μm。1x尾部游離增長(zhǎng),在胚胎頭部和卵黃囊之間可見(jiàn)葫蘆狀細(xì)胞串心臟原基。尾鰭長(zhǎng)664 μm。1y尾部伸長(zhǎng),頭部腹下方、卵黃囊正前方的心臟開(kāi)始跳動(dòng),由弱到強(qiáng),胚體伸直。開(kāi)始搏動(dòng)前面5 h跳動(dòng)頻率為40～45次/min,隨后12 h跳動(dòng)頻率為60次/min,17 h后穩(wěn)定在75次/min。1z孵出階段出膜期80.8047.45胚體加速扭動(dòng),尾部不斷拍擊,通過(guò)扭動(dòng)尾部頂破卵膜,自尾部脫膜而出。初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)約6100 μm,體高1600 μm。出膜后靜臥水底,偶能掙扎彈起,不能游動(dòng);出膜24 h仔魚(yú)全長(zhǎng)6500 μm。1aa1bb

3.2 溫度對(duì)胚胎發(fā)育和仔魚(yú)出膜的影響明顯

溫度對(duì)烏原鯉胚胎發(fā)育及出膜階段影響明顯。一是溫度對(duì)胚胎發(fā)育時(shí)間影響明顯。水溫(15±1) ℃時(shí)烏原鯉受精卵至出膜時(shí)間為116.5 h，水溫(20±1) ℃時(shí)為80.8 h。在溫度較低的條件下，胚胎發(fā)育相對(duì)遲緩，前期各階段發(fā)育時(shí)間相差較小，后期階段相差較大；二是溫度對(duì)出膜階段影響明顯。在水溫(15±1) ℃時(shí)胚胎25%～75%出膜持續(xù)時(shí)長(zhǎng)24 h，從初始出膜到完全出膜持續(xù)時(shí)長(zhǎng)約64 h。而在水溫(20±1) ℃時(shí)胚胎25%～75%出膜持續(xù)時(shí)長(zhǎng)為9 h，從初始出膜到完全出膜持續(xù)時(shí)長(zhǎng)約57 h?？梢?jiàn)水溫(20±1) ℃比水溫(15±1) ℃仔魚(yú)出膜時(shí)間更早、出膜更同步、出膜時(shí)段更集中。此外，無(wú)論(15±1) ℃還是(20±1) ℃條件下，烏原鯉出膜階段持續(xù)時(shí)長(zhǎng)均接近50 h，與巖原鯉在相同條件下發(fā)育卵孵化的時(shí)間差達(dá)30 h有類似現(xiàn)象[18]，其相關(guān)機(jī)理及影響有待研究。

3.3 去膜處理有利胚胎發(fā)育觀察研究

對(duì)胚胎進(jìn)行去膜處理，可以更清楚觀察及展現(xiàn)胚胎發(fā)育情況，有些胚胎發(fā)育研究直接采用經(jīng)脫膜胚胎發(fā)育的觀察結(jié)果[19-21]。烏原鯉受精卵具黏性表面易黏連異物，且卵膜較厚，去膜處理有利觀察胚胎內(nèi)部情況。本試驗(yàn)采用胰蛋白酶水解液對(duì)部分受精卵進(jìn)行脫膜，同步觀察未處理及經(jīng)去膜處理胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果顯示，經(jīng)3種劑量消化液脫膜處理的胚胎均能發(fā)育良好，與未脫膜處理的胚胎發(fā)育進(jìn)程基本同步，直至孵化出膜的各發(fā)育階段均未發(fā)現(xiàn)明顯發(fā)育差異。胚胎經(jīng)短時(shí)間消化處理，卵膜在較短時(shí)間內(nèi)不會(huì)完全脫落，但能去除部分表面卵膜及黏連的異物，視野會(huì)更清晰，有利觀察和拍攝。受精卵移出消化液經(jīng)Holtfreter培養(yǎng)液清洗并移入培養(yǎng)液中后，酶作用并未完全停止，消化尚在緩慢進(jìn)行，時(shí)間稍長(zhǎng)，部分受精卵膜會(huì)整體完全脫落。使用胰蛋白酶水解液消化脫膜要控制好消化時(shí)間，在顯微鏡下注意觀察，不能過(guò)度消化，避免胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

表2 鯉亞科魚(yú)類胚胎發(fā)育進(jìn)程 h

圖1 烏原鯉的胚胎發(fā)育1a：受精卵；1b：胚盤(pán)隆起；1c：2細(xì)胞期；1d：4細(xì)胞期；1e：8細(xì)胞期；1f：16細(xì)胞期；1g：32細(xì)胞期；1h：多細(xì)胞期；1i：囊胚早期；1j：囊胚中期；1k：囊胚晚期；1l：原腸早期；1m：原腸中期；1n：原腸晚期；1o：神經(jīng)胚期；1p：胚孔封閉期；1q：肌節(jié)形成期；1r：眼基形成期；1s：眼囊形成期；1t：尾芽出現(xiàn)期；1u：尾鰭形成期；1v：晶體形成期；1w：肌肉效應(yīng)期；1x：耳石形成期；1y：心臟形成期；1z：心臟摶動(dòng)期；1aa：初孵仔魚(yú)(前部側(cè)面)；1bb：初孵仔魚(yú)(前部背面).

參考文獻(xiàn)：

[1] 周解,張春光,甘西,等.廣西淡水魚(yú)類志[M].2版.南寧:廣西人民出版社,2006:346-348.

[2] 王幼槐.中國(guó)鯉亞科魚(yú)類的分類、分布、起源及演化[J].水生生物學(xué)集刊,1979,6(4):419-438.

[3] 樂(lè)佩奇,陳宜瑜.中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū):魚(yú)類[M].北京:科學(xué)出版社,1998.

[4] 吳清毅,孫翰昌,李云瑤.不同濃度的K+、Ca2+和葡萄糖對(duì)烏原鯉精子活力的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2011,30(4):202-205.

[5] 張劍英,郭起治.寄生于烏原鯉鰓上之指環(huán)蟲(chóng)兩新種的記述[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),1984,8(1):69-73.

[6] 劉筠.中國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類繁殖生理學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993.

[7] 樓允東.組織胚胎學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.

[8] 姜海峰,耿龍武,佟廣香,等.池養(yǎng)鏡泊湖蒙古鲌的人工繁殖及胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育觀察[J].水產(chǎn)科學(xué),2016,35(2):130-135.

[9] 郭文學(xué),張永泉,張有全,等.黑斑狗魚(yú)胚胎發(fā)育的研究[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2015,28(2):16-21.

[11] 高曉田,肖國(guó)華,陳力,等.江鱈胚胎發(fā)育的觀察[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2012,25(1):14-18.

[12] 陳紅菊,姜運(yùn)良,宋憬愚,等.泰山赤鱗魚(yú)胚胎發(fā)育的研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2008,32(6):926-933.

[13] 李家樂(lè).池塘養(yǎng)魚(yú)學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[14] 庹云.巖原鯉胚胎、胚后發(fā)育與早期器官分化的研究[D].重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[15] 陳少蓮.鯉魚(yú)(CyprinuscarpioLinné)胚胎發(fā)育的觀察[J].動(dòng)物學(xué)雜志,1960(4):165-168.

[16] 楊家堅(jiān),梁軍能,盧兆發(fā).三角鯉人工繁殖研究[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,16(6):555-559.

[17] 馬海艷,周賀,高養(yǎng)春,等.銀鯽與普通鯽早期胚胎發(fā)育的比較研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2015,30(5):472-477.

[18] 刁曉明,蘇勝齊,劉建虎,等.巖原鯉人工繁殖初報(bào)及胚胎發(fā)育觀察[J].重慶水產(chǎn)，2000(4):29-31.

[19] 虞鵬程,張豐旺.鄱陽(yáng)湖漁區(qū)的團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育觀察[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),1998,5(1): 103-108.

[20] 黃玉玲,彭敏,何安尤,等.翹嘴紅鲌胚胎發(fā)育研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào),2005,21(3):148-154．

[21] 殷海成,呂海英.黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(6):127-130.