趙毛香 黃曉冰鐘碧蓮 王 凌

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510375）

傷科紫草油為我院注冊制劑，主要成分為紫草、大黃、白及等，具有清熱涼血，活血解毒，逐瘀止痛等功效，臨床用于跌打損傷、骨折腫痛、軟組織損傷及燙傷未潰等，療效確切，不良反應(yīng)少[1]。為了有效控制傷科紫草油的質(zhì)量，保證微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，確保方法的科學(xué)性，本文根據(jù) 《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查方法的要求[2]，對(duì)傷科紫草油微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)方法，以及金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等控制菌檢查方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 電子分析天平 （JA1103），臺(tái)式滅菌器（MOST-T），臺(tái)式高速離心機(jī) （TGL-16G），干熱滅菌器（BOS-150）， 生化培養(yǎng)箱 （LRH-70）。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉菌 [CMCC(F)98003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌 [CMCC(B)10104]，購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，購于廣東環(huán)凱公司。

1.4 稀釋劑 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%的無菌氯化鈉溶液，按2010年版 《中華人民共和國藥典（一部）·附錄》方法配制。

1.5 樣品 傷科紫草油 （批號(hào)：110801、110802、110803），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌接種至營養(yǎng)肉湯中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，白色念珠菌接種至改良馬丁培養(yǎng)物，25℃培養(yǎng)24 h。上述菌種各取1 mL，加入0.9%的無菌氯化鈉溶液9 mL，稀釋至菌懸液濃度為50～100 cfu/mL。黑曲霉采用斜面培養(yǎng)，置于20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后加3～5 mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液 （含0.05%聚山梨酯80），洗下霉菌孢子，取孢子菌液，加入0.9%的無菌氯化鈉溶液 （含0.05%聚山梨酯80）稀釋為50～100 cfu/mL的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 取本品10 mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖5 min，混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組 分別取1 mL供試液和試驗(yàn)菌液，菌液濃度為50～100 cfu/mL，采用平皿培養(yǎng)法，平行制備2個(gè)平皿，根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法試驗(yàn)。

2.3.2 菌液組 取1 mL試驗(yàn)菌液，菌液濃度為50～100 cfu/mL，采用平皿培養(yǎng)法，平行制備兩個(gè)平皿，根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法試驗(yàn)，測定試驗(yàn)中加入的活菌數(shù)。

2.3.3 供試品對(duì)照組 取供試液，根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法試驗(yàn)，測定供試品本底菌數(shù)。

各試驗(yàn)菌開展獨(dú)立的平行試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次，計(jì)算每次試驗(yàn)的回收率。各菌株回收率=(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表1。

表1 傷科紫草油細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)果

從表1可以看出：傷科紫草油根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法開展方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明供試品5種菌回收率均符合藥典規(guī)定的大于70%的要求，證明本品無明顯抑菌作用，傷科紫草油可采用常規(guī)方法進(jìn)行微生物限度檢查。

2.4 控制菌 （金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 陽性對(duì)照組 取10 mL供試液、1 mL金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時(shí)采用120 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基直接培養(yǎng)；取10 mL供試液、1 mL銅綠假單胞菌試驗(yàn)菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時(shí)采用120 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基直接培養(yǎng)。根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法開展試驗(yàn)。

2.4.2 陰性菌對(duì)照組 取10 mL供試液、1 mL大腸埃希菌試驗(yàn)菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時(shí)采用120 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基直接培養(yǎng)；取10 mL供試液、1 mL大腸埃希菌試驗(yàn)菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時(shí)采用120 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基直接培養(yǎng)。根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法開展試驗(yàn)。

2.4.3 供試品對(duì)照組 取供試液適量，根據(jù)2010年版《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法的要求，采用常規(guī)檢查法對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌進(jìn)行檢查。

各試驗(yàn)菌開展獨(dú)立的平行試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 傷科紫草油控制菌常規(guī)檢查法驗(yàn)證結(jié)果

由表2可知，陽性對(duì)照組檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，陰性菌對(duì)照組和供試品對(duì)照組均未檢出，表明可用常規(guī)法對(duì)傷科紫草油進(jìn)行控制菌檢查。

3 成品微生物限度檢查

取3批傷科紫草油，根據(jù)2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法的要求，采用常規(guī)方法進(jìn)行檢查。檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 傷科紫草油微生物限度檢查結(jié)果 （cfu/mL）

由表3可知，對(duì)傷科紫草油采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果均符合2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》中搽劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。

4 討論

藥品微生物限度檢查是控制藥品質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，為了保證方法的可靠性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡可能與藥品中所含微生物的真實(shí)值接近，必須根據(jù)2010年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定進(jìn)行方法驗(yàn)證[3]。

微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代次數(shù)不得超過5代，并需要定期進(jìn)行菌種鑒定，以檢查菌種有無變異或污染，保證驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。枯草芽孢桿菌在平皿上生長時(shí)容易粘連成片，影響計(jì)數(shù)，可將50～100 cfu菌液于平皿上充分點(diǎn)散開，倒入瓊脂后充分搖勻，菌落呈點(diǎn)狀，易于計(jì)數(shù)[4]。

跌打損傷、骨折腫痛、軟組織損傷及燙傷未潰等，治宜清熱涼血，活血解毒，逐瘀止痛。傷科紫草油是由多味中藥制成的復(fù)方制劑，方中紫草性味苦寒，有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑之功效，為主藥；輔以大黃涼血解毒、瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)；佐以冰片芳香走竅，清熱止痛。諸藥合用，共奏清熱涼血，活血解毒，逐瘀止痛等功效，臨床上使用多年，療效顯著，期間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)不良反應(yīng)報(bào)告。

中藥成分復(fù)雜，對(duì)制劑成品中的微生物可能存在一定的抑制作用[5]，在開展中藥制劑微生物質(zhì)量檢查中應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以確定采用的方法的科學(xué)性，確保方法的準(zhǔn)確性。傷科紫草油作為一種處方組方復(fù)雜的中藥制劑，存在控制菌的潛在污染，本研究按照2010年版 《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，對(duì)傷科紫草油的微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定了傷科紫草油的微生物限度檢查方法，保證了方法的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，從而確保藥品的質(zhì)量安全，同時(shí)為我院醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂和完善提供了一定的參考。

[1]胡超燕.傷科紫草油治療閉合性骨質(zhì)并發(fā)張力性水泡的療效研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄 79-88.

[3]嚴(yán)曉明，劉萌，朱燕.四種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].中國藥事，2015，29（5）:485-491.

[4]李卓亞，袁繼承.散結(jié)止痛顆粒微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].海峽藥學(xué)，2017，29（6）:37-38.

[5]李建志，王曉源，王亞賢.8種中草藥抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息，2015，32(1)：32-34.