鄧健康 牛曉娟 劉亞青 王碩

摘 要 食源性致病菌嚴重威脅著公眾健康。本研究基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，以Cy3和Cy5作為熒光供體和受體基團，利用核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）增強檢測信號，構(gòu)建了比率型熒光傳感器，用于高靈敏度檢測致病菌基因。分別標記有Cy3的R1-DNA和標記Cy5的R2-DNA形成雙鏈R1/R2，在Cy3的激發(fā)光波長激發(fā)下，由于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，Cy3的熒光被猝滅而產(chǎn)生Cy5的熒光信號。致病菌靶基因（大腸桿菌Lac Z 基因）的存在可將R1/R2雙鏈解旋，使得Cy3遠離Cy5，導致Cy3的熒光恢復而Cy5的熒光信號降低。在Exo Ⅲ作用下，Cy3與Cy5的信號變化進一步增大。在優(yōu)化的實驗條件下，熒光信號變化與靶基因在10～2000 pmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為5.29 pmol/L。所采用的比率型信號檢測策略極大地降低了假陰性、假陽性檢測結(jié)果的產(chǎn)生，增強了檢測特異性。

關(guān)鍵詞 大腸桿菌；致病菌基因；熒光共振能量轉(zhuǎn)移；核酸外切酶Ⅲ；比率型熒光生物傳感器

1 引 言

食源性致病菌被公認為是影響全球食品安全的首要問題。食品中常見的致病菌有彎曲桿菌（Campylobacter spp.）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella spp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）及大腸桿菌（Escherichia coli）[1，2]。食用致病菌污染的食物可導致胃腸道疾病，嚴重的會損害腦及內(nèi)臟器官，甚至引起死亡[3]，嚴重威脅著公眾健康，并導致重大經(jīng)濟損失[4]。高靈敏檢測致病菌已經(jīng)成為確保食品安全和質(zhì)量的重要手段。

目前常用的食源性致病菌檢測方法有傳統(tǒng)微生物檢驗法[5]、免疫學檢測方法[6]和快速基因檢測技術(shù)[7～9]等。傳統(tǒng)的檢測方法不僅操作復雜、耗時長， 且靈敏度較低，不能滿足目前食品安全快速檢測的要求。檢測致病菌的特定序列核酸具有重要意義，發(fā)展簡單、快速、靈敏度高和準確性好的致病菌基因檢測方法已成為研究熱點[10]。等溫擴增策略已廣泛應用于核酸檢測中[11]，其中核酸外切酶Ⅲ信號放大是近年來采用較多的靈敏檢測方法，此策略操作簡便、易于設(shè)計，核酸外切酶Ⅲ無需特定識別位點，作用于雙鏈DNA，沿3'端逐步催化去除單核苷酸，對3'突出末端雙鏈DNA或單鏈DNA無活性[12]。

熒光檢測方法具有靈敏度高、易操作等優(yōu)勢，在許多領(lǐng)域應用廣泛。目前所發(fā)展的檢測致病菌基因的熒光生物傳感器通常只有單一信號輸出，僅可基于檢測信號增高（Signal-on）或者基于檢測信號降低（Signal-off），可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性的檢測結(jié)果[2，5，8，9，13，14]。而具有兩種熒光檢測信號的比率型生物傳感器則可克服以上不足。靶分子的存在會引起一種熒光基團信號增強，而另一種熒光基團信號降低，該策略不僅可提高檢測靈敏度，還可增強檢測特異性[14～16]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）原理已廣泛用于檢測DNA[8]、RNA[14，17]、金屬離子[18]、雙酚A（Bisphenol A）[19]、細菌[20]等，在生物、食品和醫(yī)學等領(lǐng)域具有重要的意義[20]。本研究發(fā)展了一種基于核酸外切酶Ⅲ信號放大的比率型熒光生物傳感器用于致病菌基因檢測，比率型檢測策略提高了檢測靈敏度和選擇性，建立的檢測方法在食品安全監(jiān)管等方面具有良好的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Lumina熒光分光光度儀、EV300紫外-可見光分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；5804R高速離心機（德國Eppendorf公司）；Bio-rad ChemDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

乙酸（HAc）、HCl、NaCl（國藥集團化學試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）、硼酸（美國Sigma-Aldrich公司）；過硫酸銨、SYBR Gold（北京索萊寶科技有限公司）；核酸外切酶Ⅲ、NE Buffer 1（美國New England Biolabs公司）。試劑均為分析純；實驗用水為超純水（>18.25 MΩ·cm）；所有核酸序列均由上海生物生工有限公司合成，其序列見表1。

2.2 實驗方法

2.2.1 DNA濃度測定 DNA濃度以單鏈濃度表示，利用紫外-可見光分光光度計測定DNA在260 nm處的吸光度，根據(jù)朗伯比爾定律（A=εbc）計算得DNA的濃度 （ε260 nm[L/（mol cm）]： A=15400， G=11500， C=7400， T=8700）。最后配制成10 μmol/L的溶液，于20℃保存待用。

2.2.2 20%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 DNA終濃度為300 nmol/L，施加電壓為110 V，時間為2 h。聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)SYBR Gold染色30 min后進行凝膠成像。

2.2.3 樣品檢測 10 μmol/L R1和10 μmol/L R2，由NE Buffer 1定容，置于1.5 mL棕色離心管中，95℃下加熱5 min，緩慢降至室溫（降溫時間至少3 h），使R1和R2序列充分雜交。將R1/R2（終濃度100 nmol/L）、不同濃度的待測樣品（Lac Z）與10 U Exo Ⅲ混合，加入20 μL 10×NE Buffer 1，加水定容至終體積為200 μL，37℃孵育，酶解反應80 min后，80℃孵育20 min，使酶失活，待混合液降至室溫后在512 nm激發(fā)波長下測定其的熒光發(fā)射光譜，光譜測定范圍為532～750 nm，激發(fā)光和發(fā)射光狹縫寬度為20 nm。待測樣品重復測定3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理

發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移的供體-受體對之間，要求供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有重疊，其能量轉(zhuǎn)移效率與供體和受體之間的距離密切相關(guān)，通常發(fā)生在10 nm的距離之內(nèi)[22]。本研究選擇Cy3和Cy5作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的能量供體和受體，為了驗證在本實驗體系下是否能滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移，分別測定了Cy3和Cy5的吸收和發(fā)射波譜。如圖1所示，Cy3的最大激發(fā)波長為512 nm，在此波長激發(fā)下，Cy3的發(fā)射波長在558 nm處達到最大值，而Cy5的吸收波長范圍則在532～750 nm之間，其最大發(fā)射波長為671 nm。Cy3發(fā)射光譜與Cy5的吸收光譜重疊。由此可知，熒光共振能量轉(zhuǎn)移可發(fā)生在分別作為供體和受體的Cy3與Cy5之間[23]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率與熒光供體受體間的距離緊密相關(guān)[24]。基于DNA的距離可控性，將Cy3和Cy5分別標記在不同的DNA序列，通過調(diào)控DNA序列的堿基數(shù)可以實現(xiàn)供體與受體間距離的調(diào)控。

本研究以大腸桿菌基因（Lac Z 基因）為模型靶分子，檢測原理如圖2A所示。與致病菌基因（Lac Z）完全互補的DNA序列（R1）5'端標記Cy3染料，R1與其部分互補的DNA序列（R2）形成DNA雙鏈（R1/R2），R2序列3'端標記有Cy5染料。R1/R2雙鏈形成使Cy3和Cy5距離靠近，形成有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系。R1/R2中的3'端突出，有效防止被Exo Ⅲ降解。在Cy3的激發(fā)波長激發(fā)下，由于FRET效應檢測到Cy5的發(fā)射光譜。在Lac Z基因存在時，由于R1與Lac Z結(jié)合能力大于其與R2的結(jié)合能力，Lac Z引發(fā)Toehold介導的鏈置換反應（Toehold-mediated strand displacement reaction）[25]，Lac Z將R1從R1/R2雙鏈中置換下來，從而形成R1的3'端為平末端的R1/Lac Z雙鏈結(jié)構(gòu)，使得Cy3遠離Cy5，由于距離的增大消除了該熒光對之間的FRET效應，Cy5的熒光信號強度降低，而Cy3的熒光信號則增強。另一方面所形成的R1/Lac Z雙鏈中R1為3'端為平末端，這種情況下Exo Ⅲ可將R1降解，從而釋放Lac Z，釋放出的Lac Z可再次與R1/R2發(fā)生鏈置換反應，由此引發(fā)循環(huán)反應，不斷產(chǎn)生游離的Cy3，使得Cy3的熒光信號增強得到進一步放大，而Cy5的熒光信號則進一步被降低?；趦煞N熒光信號強度的比值，最終實現(xiàn)對致病菌基因的高靈敏度比率檢測。

為驗證原理的可行性，測定了反應體系的熒光光譜。如圖2B所示，在R1和R2分別存在情況下，以Cy3的激發(fā)波長512 nm對體系進行激發(fā)，含有R1（標記有Cy3）的體系只檢測到Cy3的熒光響應（最大發(fā)射波長位于558 nm，圖2B， a），而含有R2的體系（標記有Cy5）則無明顯的熒光發(fā)射響應（圖2B， b），而在558 nm激發(fā)下，Cy5在671 nm處有較強的熒光響應（圖2B， d）。在形成R1/R2雙鏈后使得Cy3接近Cy5，此時以512 nm的波長激發(fā)，Cy3的發(fā)射光強度降低，而Cy5發(fā)射光強度增強（圖2B， c），證明Cy3 和Cy5之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移[24]。在加入致病菌Lac Z基因后，形成的R1/Lac Z中的R1被ExoⅢ降解，使得Cy3的熒光發(fā)射強度恢復，而Cy5熒光發(fā)射強度降低（圖2B， e）。以上實驗結(jié)果證明所設(shè)計的檢測策略是可行的。

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步證明了DNA序列間的相互反應。如圖3所示，泳道1-3分別是Lac Z、R1和R2，R2條帶染色淺，原因可能是二級構(gòu)象導致SYBR Gold染色存在差異。R1和R2形成雙鏈R1/R2后出現(xiàn)一條新的條帶（泳道4），由于R1/R2結(jié)構(gòu)不滿足Exo Ⅲ發(fā)揮酶切作用的條件，因此在加入Exo Ⅲ后仍以雙鏈形式存在（泳道8）。將Lac Z加入至R1/R2反應（泳道6），R1/R2條帶消失，一個條帶出現(xiàn)在R2位置，另一條帶則出現(xiàn)在新的位置，與R1/Lac Z雙鏈位置相同（泳道5），說明Lac Z成功地將R1從R1/R2中置換，形成了R1/Lac Z雙鏈。在此基礎(chǔ)上加入Exo Ⅲ，在酶的作用下，出現(xiàn)了一條較寬的條帶（泳道7），由于Lac Z和R2位置接近（泳道1， 3），因此推斷較寬的條帶為Lac Z和R2重合的結(jié)果。上述實驗結(jié)果證明，DNA鏈間相互反應按照所預計方式發(fā)生，再次證明所設(shè)計實驗的可行性。

3.2 實驗條件優(yōu)化

能量供體和受體間的距離對熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率起著至關(guān)重要的作用[26]。因此，通過改變DNA序列的堿基數(shù)量對Cy3-Cy5間的距離進行了優(yōu)化。本實驗設(shè)計了具有不同鏈長的T0R2、T5R2、R2和T20R2（具體序列見表1），R1-DNA序列分別與上述DNA序列退火后充分雜交，對應形成雙鏈R1/T0R2、R1/T5R2、R1/R2和R1/T20R2，Cy3和Cy5之間分別相距0、5、10和20個堿基。以Cy3的激發(fā)波長激發(fā)，以Cy5與Cy3的最大發(fā)射波長比值（F671/F558）為檢測信號，如圖4A所示，由于間隔距離不同導致Cy3和Cy5的熒光強度比值F671/F558差異較大。堿基數(shù)為10時F671/F558達到最大值，即Cy3至Cy5熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率最佳，因此，選擇Cy3和Cy5之間具有10個堿基的距離用于后續(xù)實驗。進一步實驗證明Cy3-Cy5熒光信號比較穩(wěn)定，不易受緩沖溶液影響（圖4B）。因此，本研究選擇適于Exo Ⅲ發(fā)揮作用的NE Buffer 1 （pH 7.0） 作為反應緩沖液。為獲得最佳檢測結(jié)果，對檢測體系中Exo Ⅲ用量及反應時間進行優(yōu)化。結(jié)果表明，Exo Ⅲ用量對檢測型號放大效果有明顯影響[10，27～29]。隨著Exo Ⅲ用量增加，F(xiàn)558/F671呈增大的趨勢（圖4C），酶用量為10 U時，F(xiàn)558/F671達到最大值，酶用量為20 U時，F(xiàn)558/F 671不再增大，為節(jié)省成本且保證檢測效果，后續(xù)實驗選擇10 U作為Exo Ⅲ酶反應的最佳用量。反應時間是影響酶反應效果的重要參數(shù)之一。如圖4D所示，隨反應時間延長，F(xiàn)558/F671逐漸增大，反應時間在80 min時， F558/F671達到最大值，說明反應80 min后，反應已經(jīng)達到平衡。為保證酶反應充分和檢測效率，選取80 min作為Exo Ⅲ酶反應的最佳反應時間。

3.3 基于比率型生物傳感器高靈敏檢測致病菌基因

在上述優(yōu)化的實驗條件下，以Lac Z基因（大腸桿菌基因）為靶基因進行定量檢測。在構(gòu)建的傳感體系中加入不同濃度的靶基因Lac Z，隨著Lac Z濃度的增大，Lac Z與更多的R1結(jié)合形成3'-平末端的Lac Z/R1雙鏈，使R1被Exo Ⅲ酶降解，對應的Cy3熒光信號強度增強而Cy5熒光信號強度降低，釋放的Lac Z可再次取代R形成雙鏈Lac Z/R1，從而實現(xiàn)信號變化放大（圖5A）。以F558/F671為縱坐標，Lac Z濃度為橫坐標做散點圖并進行線性擬合， F558/F671與Lac Z濃度在10～2000 pmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（圖5B），回歸方程為Y=0.00428X+0.76486，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991， 按S/N=3計算得本方法的檢出限（LOD）為5.29 pmol/L。與文獻[8，30～32]相比，本方法具有更好的檢測靈敏度。

3.4 采用構(gòu)建的比率型生物傳感器特異性檢測致病菌基因

為驗證本檢測方法的特異性，選取其它致病菌基因序列（nuc A基因（金黃色葡萄球菌）[33]、inv A基因（沙門氏菌）[9]、eae A基因（大腸桿菌O157：H7）[13]和mec A基因（金黃色葡萄球菌）[8]）進行驗證。如圖6A所示，只有靶基因Lac Z可引起明顯的信號變化，而所構(gòu)建傳感體系對其它致病菌基因沒響應，證明其對Lac Z基因具有良好的選擇性。另外，所構(gòu)建生物傳感器具有良好的區(qū)分堿基錯配的能力。如圖6B所示， 單堿基錯配的DNA（M1）序列引起的傳感體系信號的變化明顯低于靶基因引起的信號變化，而雙堿基錯配（M2）、三堿基錯配（M3）及四堿基錯配（M4）的DNA序列引起的熒光信號變化更低。

4 結(jié) 論

建立了一種基于核酸外切酶Ⅲ信號放大的比率型熒光傳感器，可用于高靈敏度、高特異性檢測致病菌基因。通過調(diào)控DNA序列，對熒光受體-給體對（Cy3-Cy5）之間的距離進行了可控調(diào)節(jié)，確定了最優(yōu)距離，提高了共振能量轉(zhuǎn)移效率，有利于檢測靈敏度的提高，對熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建具有一定的參考意義。與酶切信號循環(huán)放大策略相結(jié)合，進一步提高了檢測靈敏度，LOD值為5.29 pmol/L。 所構(gòu)建生物傳感器表現(xiàn)出良好的特異性，可對不同致病菌基因及堿基錯配序列進行區(qū)分。比率型生物傳感器的構(gòu)建還有利于降低外界環(huán)境對檢測體系的影響，從而提高檢測準確性。本方法為食源性致病菌高靈敏度高特異性檢測提供了有益參考。

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