張敬敏 朱強 盤賽昆

摘 要：以DPPH自由基清除活性為指標(biāo)對青蛤酶解條件（即時間、溫度、pH、酶添加量和固液比）進行正交試驗設(shè)計，研究了青蛤蛋白酶解物的抗氧化活性。結(jié)果表明，酶解條件為溫度40℃、pH 11.5、酶添加量3000U/g原料以及固液比為1∶2（w/w）時，酶解物的DPPH自由基的清除活性最高。對最佳水解條件下所獲得的酶解物進行抗氧化活性測試，內(nèi)容包括DPPH自由基清除活性、超氧陰離子清除活性、羥基自由基清除活性和還原能力。結(jié)果顯示，酶解物有較低超氧陰離子清除活性，但卻具有較高DPPH自由基清除活性、羥基自由基清除活性和還原能力。

關(guān)鍵詞：抗氧化；青蛤；酶解；肽

中圖分類號 R282 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）08-0025-04

Antioxidative Properties of Hydrolysates Obtained from Cyclina sinensis

Zhang Jingmin et al.

（Ocean Institute，Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005，China）

Abstract：The hydrolysates were assessed using methods of DPPH radical scavenging ability.The antioxidant properties of enzymatically hydrolyzed Cyclina sinensis were studied.Hydrolysis conditions （viz.，temperature，pH enzyme to substrate level and solid/liquid ratio） for preparing protein hydrolysates from the yclina sinensis meal proteins were optimized by orthogonal design.The results were that temperature of 40℃，pH 11.5，an enzyme to substrate level of 3000U/g ， and ratio of solid/liquid ratio of 1∶2（w/w）， were found to be the optimum conditions to obtain the best antioxidative hydrolysates.In the best hydrolysis conditions， antioxidant activities， DPPH radical scavenging activity including reducing power， superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity，of the hydrolysates were evaluated.The results showed that the hydrolysates of Cyclina sinensis exhibited the lower superoxide anion radical scavenging activities， but the higher reducing powers，DPPH radical scavenging activities and Hydroxyl radical scavenging activities.

Key words：Antioxidant；Cyclina sinensis；Enzymolysi；Peptide

海洋生物長期處于海水這樣一個特異的封閉環(huán)境里，在進化過程中產(chǎn)生了與陸地生物不同的代謝系統(tǒng)和機體防御系統(tǒng)，因此海洋生物中蘊藏著許多功能特異、結(jié)構(gòu)特殊的生理活性物質(zhì)。向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物質(zhì)，已成為世界各沿海國家海洋開發(fā)的一項重要內(nèi)容，其中海洋活性肽的開發(fā)備受科研工作者關(guān)注。

氧氣的單電子還原特點導(dǎo)致很多活性氧的產(chǎn)生，如超氧陰離子、羥基自由基等[1]?；钚匝踝鳛檠趸x的必然產(chǎn)物，在細胞的生命活動中至關(guān)重要。但過多的活性氧會使得脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛和脫氧核糖核酸產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，并由此引起基因損傷等一系列問題[2]。因此，作為機體對氧化應(yīng)激反應(yīng)的保護劑，抗氧劑的作用非常重要。一般來說，添加到食品中合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、叔丁基對苯二酚以及食子酸丙酯等均具有良好的延緩食品脂質(zhì)氧化功能。但由于合成抗氧化劑使用的安全隱患問題，人們開始越來越關(guān)注天然抗氧化劑。因此，人們致力于尋求不同來源的、安全的、天然抗氧化劑。據(jù)報道，許多蛋白經(jīng)水解后可產(chǎn)生抗氧化肽，如牛奶蛋白、牛蛙皮、豬膠原、圓鲹魷魚肌肉等[3～5]。

青蛤（Cyclina sinensis）俗稱石頭螺、圓蛤、蛤俐、黑蛤等，屬鰓綱（Lamelliranchia）、簾蛤科（Veneridae）貝類。青蛤肉質(zhì)鮮肥，深得沿海消費者的喜愛。據(jù)李小英等人報道青蛤營養(yǎng)豐富，其中蛋白質(zhì)每100g鮮品含量為11.55g，必需氨基酸占總氨酸的比例在45%左右[6]，遠高于WHO/FAO模式推薦的模式（35.38%），略低于雞蛋中所占的比例（48.08%）。

青蛤生活適應(yīng)性比較強，耐溫、耐鹽性較強，且具有一定的抗污能力，因此能夠在我國南北沿海地區(qū)生長。近十幾年來，隨著人工育苗技術(shù)的日漸成熟，青蛤在連云港灘涂貝類養(yǎng)殖中也開始占據(jù)比較重要的經(jīng)濟地位，青蛤的產(chǎn)量也在逐年增長，因此對于大宗養(yǎng)殖青蛤后續(xù)的加工特性、生物活性等方面的研究勢在必行。目前對青蛤的研究主要集中在繁殖與養(yǎng)殖生物學(xué)、群體遺傳與種質(zhì)資源評價和免疫等方面[7-9]，而對于青蛤的生物活性、加工特性等方面鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 青蛤：購自連云港直銷市場，將新鮮青蛤表面的泥沙等殘留物刷洗干凈，放入60℃水中，待其張開殼后取肉，去除內(nèi)臟，瀝干，再用清水沖洗干凈后絞成肉糜，包裝于雙層聚乙稀袋中，置于-20℃冷凍備用。堿性蛋白酶：無錫雪花酶制劑有限公司提供，20萬U/g。DPPH（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl）色譜純，購于Sigma公司。其它：氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸、氯化鈣等均為分析純。

1.2 設(shè)備 YP-001N電子精密天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；722S型分光光度計，上海樓光技術(shù)有限公司；HZS-H水浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器制造廠；GL-21M高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；pHS-25數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機，上海標(biāo)本模型廠。

1.3 酶解工藝流程 青蛤→解凍→勻漿→加熱、調(diào)pH→加酶→保溫水解4h→滅酶（90℃，20min）→破乳化→離心（8000r/min，20min）→上清液[10]

1.4 酶解條件的優(yōu)化 在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計研究堿性蛋白酶酶解溫度、pH值、加酶量和固液比4個因素對酶解液清除DPPH自由基能力的影響。

1.5 分析方法

1.5.1 酶解物肽含量 采用雙縮脲法測定酶解物肽含量。

1.5.2 DPPH自由基（DPPH·）清除活性的測定[11] DPPH自由基清除活性的測定按Bersuder法并稍加改動。將2mLDPPH自由基溶液（0.1mmol/L，溶于95%乙醇）置于試管中，加入一定量待測液定容至4ml，振蕩混勻?；旌弦菏覝胤胖?0min后，在517nm處測吸光值A(chǔ)i。對照為2mLDPPH自由基溶液加上2mL蒸餾水，并在517nm處測吸光值A(chǔ)c。同體積待測液與2ml95%的乙醇定容至4mL，并在517nm處測吸光值為Aj。DPPH自由基（DPPH·）清除活性用清除率SA（Scavenging activity）表示：

SA（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

1.5.3 羥基自由基（·OH）清除活性的測定[12] 取0.2mL FeSO4-EDTA混合液（10.0mmol/L）于5mL刻度試管中，并加入0.5mL的2-脫氧核糖溶液（10.0mmol/L），再加入0.6mL酶解物，用磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH7.4）定容至1.8mL，空白及陽性對照管直接用磷酸緩沖液定容至1.8mL。再在樣品及陽性對照管中加入0.2mL H2O2（0.1%），空白管加入蒸餾水0.2mL。溶液混勻后置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)1h，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%三氯乙酸（TCA）溶液1.0mL，4000rpm離心20min。取上清液2.0mL于另一支試管中，加入1.0%（w/w）硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL，混勻后置沸水浴中反應(yīng)15min，冷卻后稀釋5倍，在波長532nm處測吸光度值。羥自由基清除活性用清除率SA表示，按下式計算：

SA（%）=（Ac-As）/（Ac-A0）×100

式中：Ac為陽性對照管的吸光度；As為樣品管的吸光度；A0為試劑空白的吸光度。

1.5.4 超氧陰離子清除活性（O2-·）的測定[13] 向pH8.2，2.8mL的Tris-HCl緩沖液（50mmol/L）中加入0.1mL待測酶解液（空白為等量去離子水），于25℃保溫10min。然后加入0.1mL25℃預(yù)熱的鄰苯三酚（60mmol/L）至總體積3.0ml（空白以等量10mmol/L的HCl代替）。再迅速搖勻混合液，倒入1cm比色皿中，在420nm處，每隔半分鐘測定一次吸光值A(chǔ)值，線性時間為4min。根據(jù)鄰苯三酚自氧化速率計算抑制率（控制鄰苯三酚的自氧化速率為0.050～0.065O.D./min）。超氧陰離子清除活性用清除率SA表示：

SA（%）=[（△A420′/△T-△A420/△T）/△A420′/△T]×100

式中：△A420′/△T（V0）：鄰苯三酚自氧化速率O.D./min；△A420/△T（V）：添加抗氧化劑的樣液氧化速率O.D./min。

1.5.5 酶解液還原能力的測定[11] 取一定濃度的樣品（1～10mg/mL）0.1mL，加入2.5m1pH6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L）和2.5mL1%的鐵氰化鉀溶液，混勻。將混合物在50℃保溫30min后加入2.5mL10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min。然后，取上清液2.5mL，加2.5mL蒸餾水和0.5mL0.1%的FeCl3，室溫放置10min后，在700nm波長處比色，比色值越大，還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的確定 酶解最佳工藝的正交試驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，堿性蛋白酶酶解青蛤的最佳條件為A1B3C3D1，即酶解溫度40℃，pH值11.5，加酶量600U/g，固液比為1∶2。各因素對DPPH自由基清除能力的影響由大到小依次為固液比>加酶量>溫度>pH值。

2.2 青蛤肽的抗氧化能力 在以上最佳條件下對青蛤進行水解4h的水解，并對不同濃度青蛤酶水解物進行抗氧化活性測定。

2.2.1 最佳酶解條件下酶解物對DPPH自由基（DPPH·）的清除活性 根據(jù)圖1可知，青蛤酶解物在淬滅DPPH自由基時呈現(xiàn)類似米氏曲線的特點，即在較低濃度下時清除效率隨濃度增加而增加，二者幾乎呈線性關(guān)系，但當(dāng)酶解物濃度超過4mg/mL時，若濃度繼續(xù)增加則清除效率曲線趨于平緩。

2.2.2 最佳酶解條件下酶解物對超氧陰離子的清除活性 鄰苯三酚自氧化是一類鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在自氧化過程中，超氧陰離子不斷消失又不斷產(chǎn)生，達到穩(wěn)態(tài)時，其濃度保持穩(wěn)定。鄰苯三酚在氧化過程中形成一系列在400nm～425nm處有光吸收的中間產(chǎn)物，當(dāng)pH<9時，鄰苯三酚的自氧化率呈超氧陰離子濃度依賴性。

由圖2可知，青蛤酶解所獲得的混合物對超氧陰離子具有一定的清除能力。低濃度下與清除率效率與濃度存在一定的線性相關(guān)性。當(dāng)酶解混合物濃度為2mg/ml時，清除效率可達32.5%，超過這一濃度時，抗氧化能力的增長趨勢明顯減弱。

2.2.3 最佳酶解條件下酶解物對羥基自由基的清除活性 如圖3所示，在實驗所測定的濃度范圍內(nèi)，青蛤酶解物具有較強的清除羥基自由基的能力，并且該能力隨濃度的增加而增強。與清除DPPH自由基和超氧陰離子相比，青蛤酶解物清除羥基自由基的能力更強，當(dāng)酶解物濃度為20mg/ml時，清除效率高達80%。這表明在不同的抗氧化測定體系中，青蛤酶解抗氧化能力的表現(xiàn)有所差異。據(jù)此推測多肽清除不同的自由基的機理及發(fā)揮抗氧化功能的基團應(yīng)有所不同。

圖3 青蛤蛋白酶解物清除羥基自由基的活性

2.2.4 青蛤酶解物的還原能力 圖4顯示，青蛤酶解物具有一定的還原力，青蛤酶解物可做為電子供體與自由基進行反應(yīng)并將它們轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定物質(zhì)，從而終止自由基鏈反應(yīng)。由圖4可知青蛤酶解物還原力大小與其濃度高低呈一定的量效關(guān)系。這說明青蛤酶解物供電子的能力隨濃度的提高而增強，但這種線性關(guān)系會隨濃度增加而稍有減弱。

圖4 青蛤蛋白酶解物還原力活性

3 結(jié)論與討論

青蛤經(jīng)堿性蛋白酶水解后可得到具有優(yōu)良的抗氧化性能酶解物，但限于時間原因，未能對酶解物的進一步分離純化及表征，同時也未能就酶解物的食品方面功能特性進行檢測，后續(xù)實驗中擬對的酶解物以上兩方面內(nèi)容開展。若能獲取良好食品功能特性的酶解物或（和）抗氧化生物活性的純化肽，則有望提高青蛤產(chǎn)業(yè)鏈的經(jīng)濟效益及社會效益。

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（責(zé)編：王慧晴）