謝 昆， 蔣成硯， 劉 杰， 李橋善， 周文樹， 唐秀華， 汪 鏡

(1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199； 2.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661199)

奶牛乳房炎是困擾牛奶業(yè)經(jīng)濟(jì)效益及迅速發(fā)展的重要原因之一，不僅嚴(yán)重影響患病牛的產(chǎn)乳量、乳的品質(zhì)、延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情和妊娠的時(shí)間，易在牛群中傳播流行，對(duì)奶牛業(yè)的危害極大，而且危及人類健康[1]。奶牛乳房炎根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為臨床型和隱性型2種，其中隱性乳房炎(subclinic mastitis)乳汁無(wú)肉眼可見(jiàn)變化，臨床癥狀不明顯，診斷困難，療效較差，造成奶品質(zhì)量下降，最終危及人類健康[2]。

奶牛乳房炎是奶牛乳腺受到物理、化學(xué)、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳房的炎癥，表現(xiàn)為乳汁發(fā)生理化性質(zhì)及細(xì)胞學(xué)性質(zhì)的變化、乳腺組織發(fā)生病理學(xué)變化[3]。志賀氏菌大多存在腸道中，由于飼養(yǎng)員的不衛(wèi)生操作或飼養(yǎng)管理水平較低，擠奶員的素質(zhì)不高出現(xiàn)不能正確使用擠奶器或?qū)D奶系統(tǒng)沒(méi)有進(jìn)行很好的保養(yǎng)等問(wèn)題導(dǎo)致志賀氏菌的感染。志賀氏菌從損傷的生殖道進(jìn)入血液或淋巴而引起感染，多感染舍飼牛，嚴(yán)重的可引起乳房壞疽，志賀氏菌性乳房炎多見(jiàn)于高產(chǎn)奶牛及產(chǎn)后泌乳高峰時(shí)期，臨床癥狀明顯，乳房腫脹、高熱，食欲廢絕，并伴有胃腸道癥狀，乳汁水樣黃色，泌乳量急劇下降，表現(xiàn)出急性發(fā)病，少數(shù)動(dòng)物可死于內(nèi)毒素血癥[4]。

本研究從牛奶中分離出引起乳房炎的1種病原菌，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)和生理生化試驗(yàn)[5]初步鑒定病原菌為志賀氏菌，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其16S rRNA序列，并與GenBank上發(fā)布的志賀氏菌16S rRNA核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，以期為志賀氏菌導(dǎo)致的奶牛隱性乳房炎的分子生物學(xué)診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮奶樣，采自云南省紅河州個(gè)舊市乍甸奶牛場(chǎng)，由紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

普通肉湯培養(yǎng)基：取瓶?jī)?nèi)干粉39.6 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121 ℃高壓滅菌15 min；冷卻至50 ℃，搖勻倒平板。在室溫可保存1 d或在冰箱里貯存數(shù)天。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及生理生化鑒定

取新鮮奶樣200 μL接種在普通肉湯培養(yǎng)基，在37 ℃條件下無(wú)氧培養(yǎng)24 h，待菌落長(zhǎng)出后，挑出單菌落，劃線分離，直至菌落較純化，待菌株生長(zhǎng)良好后，仔細(xì)觀察菌落形態(tài)。挑選形態(tài)典型的單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。將分離得到的革蘭氏染色陰性的細(xì)菌做過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。凡是革蘭氏染色為陰性、過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生氣泡的細(xì)菌均暫定為葡萄球菌屬。再進(jìn)一步做甲基紅試驗(yàn)、各種發(fā)酵糖試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)、血凝固酶試驗(yàn)。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》來(lái)確定所屬的種。

1.4 16S rRNA的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用CTAB法提取經(jīng)過(guò)生理生化鑒定的細(xì)菌DNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的志賀細(xì)菌16S rRNA序列(GU444081.1)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物如下：P1：5′-AATGGGACGCTGGCGGC AGGCCTC-3′，P2：5′-GCGCATATGCATACGGCTACCT-3′。

以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)。將檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的志賀氏菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)特征

在普通肉湯培養(yǎng)基上，菌落為圓形半透明，平板形成濕潤(rùn)，表面光滑，邊緣有些不整齊，呈白色，中央有凸起的菌落(圖1)。分離菌的菌體都是圓形的，在顯微鏡下一般觀察到的是呈短小桿菌狀，革蘭氏染色陰性(圖2)。

分離菌的形態(tài)特征：菌落直徑在0.5～1.5 mm之間，凸起、圓形、光滑、半透明、白色，細(xì)菌為圓形，通常是以串狀存在，偶爾有單個(gè)，缺乏鞭毛。

2.2 分離菌特性的分析與鑒定

本試驗(yàn)對(duì)牛奶中分離得到的細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，由表1可知，革蘭氏染色試驗(yàn)，過(guò)氧化氫試驗(yàn)和甘露醇、賴氨酸脫羧酶、β-半乳糖苷酶、尿素試驗(yàn)等均為陰性；甲基紅試驗(yàn)、葡萄糖為陽(yáng)性，根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結(jié)果，試驗(yàn)分離出的細(xì)菌初步確定為志賀氏菌屬。

2.3 分離菌DNA提取結(jié)果

由圖3可知，分離菌的DNA提取結(jié)果可見(jiàn)分離菌DNA提取了12個(gè)樣，而3、4、5、6、7、8泳道幾個(gè)樣效果較好，可以用來(lái)做16S rRNA的擴(kuò)增。

表1 分離細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+為陽(yáng)性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)。

2.4 分離菌16S rRNA的擴(kuò)增結(jié)果

由圖4可知，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到16S rRNA片段，一共擴(kuò)增了10個(gè)樣，每個(gè)條帶都很清晰，說(shuō)明PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序都正確，其大小約為1 500 bp。

2.5 同源性比較

PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序后，結(jié)果表明序列大小與預(yù)期結(jié)果一致，將測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的志賀氏菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的核苷酸序列與GenBank上發(fā)表的Shigella16S rRNA序列同源性達(dá)到99.9%(圖5)。

3 討論

志賀氏菌屬(Shigella)是人類細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌，通稱痢疾桿菌[6-8]。志賀氏菌是一類兼性厭氧、不產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陰性桿菌[9]。志賀氏菌屬細(xì)菌桿狀或短桿狀，沒(méi)有成莢膜，無(wú)鞭毛，一般有菌毛的形態(tài)與一般腸道桿菌無(wú)明顯區(qū)別，長(zhǎng) 2～3 μm、寬 0.5～0.7μm，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[10]；最適生長(zhǎng)溫度為 37 ℃，最適 pH 值為 6.4～7.8。志賀氏菌可分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解尿素，不形成硫化氫，不能利用檸檬酸鹽或丙二酸鹽作為唯一碳源[11-12]。

志賀氏菌的分離也受到人們的關(guān)注，現(xiàn)在關(guān)于志賀氏菌的分離多數(shù)是在臨床上進(jìn)行的，而在動(dòng)物方面的分離應(yīng)用還較少，對(duì)該細(xì)菌的分離手段越來(lái)越多[13]，由于現(xiàn)在技術(shù)的發(fā)達(dá)，在很多試驗(yàn)室已經(jīng)使用全自動(dòng)的微生物檢定儀、分子鑒定方法等對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離及鑒定[14]。

隱性乳房炎是危害奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。造成隱性乳房炎的主要病原微生物包括來(lái)源于環(huán)境污染的大腸埃希氏菌、乳房鏈球菌、化膿性棒狀桿菌等，以及通過(guò)接觸性傳染的無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌等，但以大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌為主，引起我國(guó)奶牛乳房炎的病原菌中金黃色葡萄球菌分離率達(dá)到了約40%，大腸埃希氏菌分離率約為30%，停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌及其他細(xì)菌所占比例較低[15]。對(duì)這些病原菌的鑒定主要以生理生化鑒定為主，借助于分子生物學(xué)鑒定奶樣中志賀氏菌的相關(guān)文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道[16-17]。本研究根據(jù)GenBank中登錄的志賀氏菌16S rRNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)從經(jīng)過(guò)生理生化鑒定的細(xì)菌DNA中擴(kuò)增16S rRNA，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序與同源性對(duì)比，結(jié)果表明分離的病原菌經(jīng)PCR鑒定為志賀氏菌， 為隱性乳房炎中志賀氏菌的分子生物學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，為隱性乳房炎中志賀氏菌的檢測(cè)提供了新的方法和參考依據(jù)，該研究具有重要的意義。

細(xì)菌的分離鑒定方法很多，可以是常規(guī)的生化鑒定，也可以是分子生化鑒定，包括DNA測(cè)定、PCR技術(shù)、血清鑒定等[18-20]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的人采用分子生物學(xué)鑒定方法，利用分子生物學(xué)鑒定能更快速便捷地檢測(cè)出隱性乳房炎中的病原微生物[21-23]。本試驗(yàn)應(yīng)用常規(guī)生化鑒定方法和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，雖然該方法所需的時(shí)間較長(zhǎng)，耗費(fèi)的人力物力較多，但是最終鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度高，是其他檢測(cè)方法無(wú)法比擬的。

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