丁澤紅， 付莉莉， 吳春來， 胡 偉

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南海口 571101)

海藻糖是由2個葡萄糖分子通過α-1，1糖苷鍵結(jié)合而成的非還原性雙糖[1]。海藻糖具有生物抗逆性，其含量在干旱、低溫、氧化和熱脅迫等條件下被大量積累[2]，可以在非生物脅迫下保護(hù)核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等生物大分子物質(zhì)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性[3-4]。海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，簡稱TPS)是海藻糖生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在TPS催化作用下生成6-磷酸海藻糖，之后在海藻糖-6-磷酸酯酶的水解作用下生成海藻糖[5]。在大多數(shù)植物中，海藻糖的含量非常低(鮮質(zhì)量含量<10 μmol/g)，但是通過調(diào)節(jié)TPS基因的表達(dá)可以提高海藻糖的含量并且不影響植株生長[6]。將擬南芥AtTPS1基因轉(zhuǎn)入煙草后，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)海藻糖含量顯著增加，其耐受鹽脅迫的能力顯著增強(qiáng)[4]。在干旱、低溫和高鹽條件下，水稻OsTPS1轉(zhuǎn)基因植株抗性明顯增強(qiáng)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)海藻糖含量約增加了2倍[3，7]。TPS基因的表達(dá)受到干旱、低溫、遮陰等非生物脅迫的調(diào)控。在低溫脅迫條件下，茶樹CsTPS、辣椒CaTPS、小麥TaTPS的表達(dá)量顯著增加[8-10]；在干旱脅迫條件下，棉花GhTPS和海帶SjTPS的表達(dá)量顯著增加[11-13]；在遮陰脅迫條件下，玉米TPS基因的表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化[14]。此外，TPS基因的表達(dá)量在植物的不同組織中也不盡相同，呈現(xiàn)出差異表達(dá)的特點(diǎn)[8-9]。這些研究充分表明，TPS是一個重要的抵御干旱、低溫等非生物脅迫的候選基因，提高其表達(dá)水平可以增強(qiáng)植物的抗逆性。

木薯是大戟科塊根植物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物。木薯具有較好的抗旱特性，然而在長時間或較為嚴(yán)重的干旱條件下，其塊根產(chǎn)量會顯著下降[15-16]。除了干旱，木薯產(chǎn)量還常常受到低溫、遮陰等環(huán)境因素的影響。作為典型的熱帶作物，木薯對低溫脅迫非常敏感，極端的低溫天氣可造成木薯產(chǎn)量大幅減少甚至絕收[17]。此外，由于長期受耕作方式的影響，在某些經(jīng)濟(jì)落后的地區(qū)(如拉丁美洲)，農(nóng)民常常將木薯和橡膠樹、玉米等作物間作在一起，以達(dá)到土地使用效率的最大化。在這種情況下，木薯經(jīng)常會受到不同程度的遮陰，其產(chǎn)量也會顯著減少[18-19]。因此，提高木薯對干旱、低溫、遮陰等非生物脅迫的耐受性，使其在惡劣環(huán)境下維持原有塊根產(chǎn)量，或是減少產(chǎn)量的損失具有重要意義。

至今，尚沒有關(guān)于木薯TPS基因克隆及其參與非生物脅迫調(diào)控的報道。本研究采用同源基因克隆的方法從木薯葉片中克隆了1個海藻糖合成酶基因(命名為MeTPS1)，之后從進(jìn)化樹、保守結(jié)構(gòu)域和啟動子元件等方面對其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，同時研究其在不同組織之間，以及在干旱、低溫、遮陰和脫落酸(ABA)脅迫處理下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究MeTPS1的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用木薯材料為木薯栽培品種Ku50，它具有高產(chǎn)、高淀粉含量的特性，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。RNA提取試劑盒(貨號：DP437)，購自天根生化科技(北京)有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：K1622)，購自Fermentas公司。

1.2 木薯種植與處理

木薯種植按照Ding等的方法[19-20]進(jìn)行：在木薯種植季節(jié)(2013年5月)，將木薯種莖切成長度約15 cm的莖段，挑選粗細(xì)均勻一致且具有3～4個芽眼的莖段扦插于塑料盆(高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm)中，每盆1個莖段。基質(zhì)采用營養(yǎng)土與蛭石以體積比1 ∶1進(jìn)行混合。木薯種植約10 d后進(jìn)行間苗，保留1株/盆。試驗(yàn)地點(diǎn)為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

PEG處理：種植60 d后，選取長勢一致的植株，用20% PEG 6000溶液進(jìn)行模擬干旱處理，同時以不施PEG(澆灌自來水)的植株為對照。在處理0、3、24 h后，分別收集未展開葉、第1張完全展開葉、老葉和根的樣品，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

低溫處理：種植60 d后，選取長勢一致的植株放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理。在處理0、6、24 h后，分別收集未展開葉、第1張完全展開葉和根的樣品，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ABA處理：種植60 d后，選取長勢一致的植株，采用 100 μmol/L ABA溶液進(jìn)行澆灌處理，在處理0、3、5、7 d后收集第1張完全展開葉的樣品，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

遮陰處理：將遮陰處理的木薯種植于橡膠樹下，將對照處理的木薯種植于室外。種植60 d后，選擇生長狀況較一致的植株，收集未展開葉、第1張完全展開葉和老葉的樣品，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了比較不同組織中MeTPS1基因的表達(dá)情況，筆者還收集了木薯Ku50葉片、葉柄、莖、須根和儲藏根的樣本，用于實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，簡稱qRT-PCR)分析。

1.3 引物合成及qRT-PCR

采用Primer 6.0軟件設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，包括actin基因引物(L1：5′-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3′；R1：5′-CCTCCTACG ACCCAATCTCA-3′)[21]、MeTPS1基因qRT-PCR引物(L2：5′-TAGACACTCCTGGGCGAAGA-3′；R2：5′-CTGCC AGCCACATGTCAAAC-3′)和MeTPS1基因全長擴(kuò)增引物(L3：5′-ATGCCTGGAAACC AGTACAACA-3′；R3：5′-TCAAGGAGATGCATTGGCT-3′)。采用RNA提取試劑盒抽提木薯總RNA，之后用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｓ肧YBR Green Ⅰ試劑盒(TaKaRa公司)，按照操作說明在Mx 3005P熒光定量PCR儀(Stratagene，美國)上進(jìn)行qRT-PCR分析。每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，表達(dá)量按照2-ΔΔCT計算[22]。

1.4 生物信息學(xué)分析

用ExPASy ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)；用Plant-mPLoc軟件預(yù)測亞細(xì)胞定位情況；用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫分析保守結(jié)構(gòu)域；用BLASTp搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲取其他物種與MeTPS1同源的蛋白質(zhì)序列；用ClustalX進(jìn)行序列比對；用MEGA5.2軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；用PlantCARE進(jìn)行啟動子元件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1MeTPS1基因克隆

用擬南芥AtTPS1基因(登錄號：At1g78580)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTp搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲得其在木薯中的同源序列(cassava4.1_001223m)，之后設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)。測序后獲得1個全長為2 781 bp的序列，編碼926個氨基酸(圖2)，根據(jù)該序列與擬南芥TPS基因的同源性，將其命名為MeTPS1。經(jīng)序列比對，發(fā)現(xiàn)MeTPS1與參考序列之間共存在3個堿基差異，其中1個為非同義突變(圖2)。將MeTPS1與基因組序列比對得知，該基因含有17個外顯子和16個內(nèi)含子。ProtParam理化性質(zhì)預(yù)測MeTPS1蛋白質(zhì)的分子式為C4 639H7 296N1 314O1 382S32，分子量為104 614.86 u，理論等電點(diǎn)(pI)為6.34，不穩(wěn)定系數(shù)為49.05，屬于不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)定位于葉綠體。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，MeTPS1編碼的蛋白含有TPS家族保守結(jié)構(gòu)域(Glyco_transf_20，圖3)，進(jìn)一步表明克隆得到的基因?yàn)槟臼鞰eTPS1基因。

2.2 MeTPS1基因進(jìn)化樹分析

采用BLASTp同源比對的方法，筆者獲取了其他物種中與MeTPS1同源性較高的蛋白質(zhì)序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，這些基因大體上可以被分為3組：第Ⅰ組以C4物種為代表，包括谷子、狗尾草、玉米、高粱、黍羊、柳枝稷和二穗短柄草；第Ⅱ組以楊柳目的物種為代表，包括木薯、楊樹和杞柳，因此MeTPS1與其在楊樹(Potri.011G103900.2)、杞柳(SapurV1A.0026s0140.6)中同源基因的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別為88.1%、89.4%；第Ⅲ組以十字花科的物種為代表，包括白菜型油菜、擬南芥、薺菜花、琴葉擬南芥和鼠耳芥(圖4)。

2.3 MeTPS1基因啟動子元件分析

啟動子是控制基因轉(zhuǎn)錄起始時間和表達(dá)程度的重要組成部分。本研究選取MeTPS1起始密碼子上游1 500 bp的序列進(jìn)行啟動子元件分析，發(fā)現(xiàn)了一些與脅迫相關(guān)的元件，如干旱誘導(dǎo)元件MBS、熱脅迫響應(yīng)元件HSE、以及防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats(表1)。除此之外，筆者還發(fā)現(xiàn)一些與激素相關(guān)的元件，如赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、生長素響應(yīng)元件TGA-element，以及與光響應(yīng)相關(guān)的元件，如ACE、Box 4和Box I等(表1)。這些結(jié)果表明，MeTPS1可能參與木薯干旱、高溫/低溫、 激素和光照(如遮陰)相關(guān)的基因調(diào)控。

表1 MeTPS1基因啟動子元件分析

2.4 MeTPS1基因在木薯不同組織中的表達(dá)分析

前人研究表明，TPS基因在植物不同組織器官中的表達(dá)量差異很大。本研究考察了MeTPS1基因在木薯Ku50不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，MeTPS1在葉片中的表達(dá)量最高，其次是莖、葉柄、須根和儲藏根中的表達(dá)量，分別是葉片中的49%、27%、16%、5%(圖5)。這些結(jié)果表明，MeTPS1基因主要在木薯的葉片中起作用，而在根(特別是儲藏根)中的作用可能比較有限。

2.5 MeTPS1基因在不同脅迫條件下的表達(dá)分析

本研究分別考察了MeTPS1基因在干旱、低溫、遮陰和ABA處理?xiàng)l件下不同組織中的表達(dá)情況。在PEG 6000脅迫條件(模擬干旱)下，MeTPS1的表達(dá)量在未展開葉中呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢， 在脅迫處理3、24 h后與處理0 d相比分別上升了30%、下降了40%；在第1張完全展開葉和老葉中，MeTPS1的表達(dá)量在3 h內(nèi)均沒有顯著變化，而在24 h分別下降了50%和70%；在根中MeTPS1的表達(dá)量在3 h上升了60%，之后在24 h又恢復(fù)到初始水平(圖6-A)。在低溫脅迫條件下，MeTPS1的表達(dá)量在不同組織中也呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式：在未展開葉中MeTPS1的表達(dá)量先下降后上升；在第1張完全展開葉中，MeTPS1的表達(dá)量持續(xù)上升，在低溫處理6、24 h后分別上升了1.3、2.2倍；在根中，MeTPS1的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(圖6-B)。在遮陰條件下，MeTPS1的表達(dá)量在未展開葉、第1張完全展開葉中沒有顯著變化，但在老葉中其表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)了，增加了約30%(圖6-C)。然而，在ABA處理3、5、7 d后，MeTPS1的表達(dá)量均沒有顯著變化(圖6-D)。

這些結(jié)果充分表明，MeTPS1基因的表達(dá)受到干旱、低溫和遮陰處理顯著誘導(dǎo)，在木薯各組織中呈現(xiàn)截然不同的表達(dá)模式，但是MeTPS1基因表達(dá)量與ABA脅迫處理沒有表現(xiàn)出必然聯(lián)系。

3 討論與結(jié)論

TPS是海藻糖生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，是植物進(jìn)行遺傳改良以抵御干旱、低溫等逆境脅迫的一個重要候選基因。植物中TPS基因以基因家族的形式存在，絕大部分TPS蛋白都含有TPS基因家族保守結(jié)構(gòu)域[14]。目前，人們已經(jīng)先后從擬南芥[23]、水稻[7]、小麥[10]、棉花[12]、茶樹[8]、香蕉[24-25]、辣椒[9]等多個物種中克隆了TPS基因，并對其功能進(jìn)行了深入研究，但在木薯中尚沒有TPS基因克隆的相關(guān)報道。本研究采用同源基因克隆的方法，從木薯葉片中克隆了1個TPS基因，命名為MeTPS1。序列分析表明，MeTPS1編碼926個氨基酸，含有TPS家族保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明，MeTPS1與楊樹和杞柳TPS基因的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別達(dá)到88.1%和89.4%。

許多研究表明，TPS基因在植物不同組織器官中的表達(dá)量差異很大[8-9，26]。例如，辣椒CaTPS在葉片中的表達(dá)量大約是根和莖中的5～6倍[9]；香蕉MaTPS在葉片、球莖和花中的表達(dá)量較大，而在根和果實(shí)中的表達(dá)量極少[25]；茶樹CsTPS基因在花中的表達(dá)量最高，在根中的次之，其次是在莖、芽、葉和種子中的，且表達(dá)豐度僅為花的13%～41%[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，MeTPS1在葉片中的表達(dá)量最高，其豐度是莖、葉柄、須根和儲藏根的2～20倍，呈現(xiàn)出明顯的組織表達(dá)特異性。這些研究結(jié)果表明，TPS基因可能在植物不同組織中扮演著不同的功能。

TPS基因的表達(dá)量受到干旱、低溫、遮陰等非生物脅迫的誘導(dǎo)[11，14]。在干旱脅迫條件下，棉花GhTPS和海帶SjTPS的表達(dá)量顯著增強(qiáng)[11-12]；在低溫脅迫條件下，茶樹CsTPS和辣椒CaTPS的表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)[8-9]。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，通過對MeTPS1啟動子序列分析，發(fā)現(xiàn)了干旱相關(guān)元件MBS、熱脅迫相關(guān)元件HSE，以及許多與光響應(yīng)相關(guān)的元件(如ACE、Box I、Box 4等)，從而提示MeTPS1可能參與木薯干旱、低溫和光照(如遮陰)相關(guān)的基因調(diào)控。脫落酸(abscisic acid，簡稱ABA)是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育非常重要的一種激素，是植物響應(yīng)干旱、低溫等非生物脅迫信號的傳導(dǎo)者[27-30]。為此，筆者分別在干旱、低溫、遮陰和ABA處理?xiàng)l件下，在木薯不同葉片和根中對MeTPS1基因的表達(dá)模式進(jìn)行詳細(xì)的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，MeTPS1基因表達(dá)受干旱、低溫和遮陰脅迫顯著誘導(dǎo)，但對ABA脅迫處理沒有明顯反應(yīng)，暗示MeTPS1參與木薯干旱、低溫和遮陰脅迫反應(yīng)的信號傳導(dǎo)路徑是不依賴于ABA的。這一點(diǎn)與MeTPS1啟動子元件的分析結(jié)果是一致的，因?yàn)楸狙芯繘]有發(fā)現(xiàn)任何與ABA響應(yīng)相關(guān)的元件。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究MeTPS1參與木薯非生物脅迫的分子機(jī)制奠定了扎實(shí)的工作基礎(chǔ)，同時也為木薯抗逆遺傳改良工作的實(shí)施提供了重要的理論依據(jù)。

本研究克隆了1個木薯海藻糖合成酶基因MeTPS1，該基因編碼926個氨基酸，含有TPS家族保守結(jié)構(gòu)域，它與楊樹和杞柳中同源基因的親緣關(guān)系較近。啟動子元件分析表明，MeTPS1含有干旱誘導(dǎo)元件(MBS)、熱脅迫響應(yīng)元件(HSE)、防御和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)以及光響應(yīng)元件(ACE、Box I、Box 4)等。表達(dá)分析結(jié)果顯示，MeTPS1在葉片中的表達(dá)量最高，在須根和儲藏根中的表達(dá)量最低。而且，MeTPS1基因的表達(dá)能被干旱、低溫和遮陰脅迫處理顯著誘導(dǎo)，但對ABA脅迫處理無明顯響應(yīng)。因此可見，MeTPS1可作為一個重要的候選基因應(yīng)用于木薯抗逆遺傳改良中。

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