吳三橋， 趙冠杰， 萬 健， 陳 琛

(陜西理工大學生物科學與工程學院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西漢中 723000)

近年來，抗生素的長期使用所帶來的負面效應(yīng)已越來越引起全社會的高度關(guān)注，藥物殘留和細菌耐藥性等問題日漸嚴重，特別是2010年出現(xiàn)的“超級細菌”[1]事件再一次將濫用抗生素引發(fā)的日益嚴重的耐藥菌株等問題擺在了公眾面前，長期濫用抗生素所引起的食品安全、人類健康、環(huán)境污染等問題也受到了公眾的廣泛關(guān)注。因此，研制安全、高效、環(huán)保型抗生素替代品已迫在眉睫。

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，具有抵抗外界微生物侵害的作用，是生物天然免疫系統(tǒng)中的一個重要組成部分，與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有熱穩(wěn)定好、水溶性好、強堿性、廣譜抗菌和作用機制獨特等特點[2-3]。

抗菌肽SMAP-29(sheep myeloid antibacterial peptides-29)是1995年Bagella等從綿羊Cathelicidins前體蛋白的羧基端截取的29個氨基酸殘基序列，具有兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)域，分子量約為3.2 ku，有很強的抗細菌、真菌、病毒等生物學功能[4-11]。抗菌肽SMAP-29天然含量非常低，化學合成成本較高，因此通過基因工程表達具有較好的前景?？咕腟MAP-29基因工程表達已有大量研究報道，但是未見采用小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier，SUMO)融合表達報道。

本試驗以抗菌肽SMAP-29為研究對象，通過已構(gòu)建的表達載體pSUMO-SMAP-29在大腸桿菌中誘導表達融合蛋白SUMO-SMAP-29，優(yōu)化了融合蛋白SUMO-SMAP-29在大腸桿菌中的表達條件，并通過Ni柱親和層析純化了目的蛋白，旨在為其生物活性以及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑

含有pSUMO-SMAP-29表達質(zhì)粒的EscherichiacoliBL21(DE3)菌種由筆者所在實驗室保存。

Protein Marker、IPTG、卡那霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Ni Sepharose柱購自美國GE Healthcare公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 融合蛋白SUMO-SMAP-29表達條件的優(yōu)化

1.2.1 細菌培養(yǎng) 將含重組質(zhì)粒pSUMO-SMAP-29的E.coliBL21菌種接種于LB(50 μg/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取新鮮單克隆接種于5 mL LB(50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2 不同濃度IPTG對目的蛋白表達量的影響 細菌培養(yǎng)方法同“1.2.1”節(jié)，然后按體積比1 ∶100的轉(zhuǎn)接量將過夜培養(yǎng)的菌液接種于50 mL新鮮LB(50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。當D600 nm約0.6時加IPTG至終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L，在 37 ℃ 誘導1 h后各取樣1 mL進行SDS-PAGE電泳分析。通過Quantity One和SPSS軟件，分析融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量，以及IPTG濃度梯度各組之間是否有統(tǒng)計學差異。

1.2.3 不同誘導溫度對目的蛋白表達量的影響 細菌培養(yǎng)方法同“1.2.1”節(jié)，然后按體積比1 ∶100的轉(zhuǎn)接量將過夜培養(yǎng)的菌液接種于50 mL新鮮LB(50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。當D600 nm約0.6時加IPTG至終濃度為0.50 mmol/L，分別在25、30、37、42 ℃誘導，1 h 后各取樣1 mL，進行SDS-PAGE電泳分析。通過Quantity One和SPSS軟件分析融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量，以及誘導溫度梯度各組之間是否有統(tǒng)計學差異。

1.2.4 不同誘導時間對目的蛋白表達量的影響 細菌培養(yǎng)方法同“1.2.1”節(jié)，然后按體積比1 ∶100的轉(zhuǎn)接量將過夜培養(yǎng)的菌液接種于50 mL新鮮LB(50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)至D600 nm約0.6時，加0.50 mmol/L IPTG，在30 ℃條件下誘導，分別于0、1、3、5、7 h取樣1 mL，進行SDS-PAGE電泳分析。通過Quantity One和SPSS軟件分析融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量，以及誘導時間梯度各組之間是否有統(tǒng)計學差異。

1.3 融合蛋白SUMO-SMAP-29的分離純化

取誘導表達后的菌液離心收集菌體，用Binding Buffer(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH值 8.0)重懸菌體，冰浴超聲破菌，離心收集上清。將含目的蛋白的細菌破碎液上樣于Ni-NTA純化柱，調(diào)整流速(≤1.5 mL/min)后，用Wash Buffer(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH值8.0)洗去雜蛋白，再用Elution Buffer(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH值8.0)洗脫，收集洗脫液，SDS-PAGE分析，其余樣品用PBS于4 ℃過夜透析，透析液冷凍干燥后存于-80 ℃超低溫冰箱。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合蛋白SUMO-SMAP-29誘導表達條件的優(yōu)化

2.1.1 不同IPTG濃度對大腸桿菌表達融合蛋白SUMO-SMAP-29的影響 SUMO標簽蛋白分子量為14 ku，但是實際表現(xiàn)為18 ku，可能與其特殊的三級結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]?？咕腟MAP-29的分子量為3.2 ku，因此，融合蛋白的分子量表現(xiàn)為21 ku左右。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖1)表明，在21 ku處可以明顯看到融合蛋白SUMO-SMAP-29得到表達。0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L濃度的IPTG均能誘導大腸桿菌表達融合蛋白SUMO-SMAP-29。

通過Quantity One和SPSS軟件，對不同IPTG濃度誘導情況下融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量進行分析，結(jié)果如表1和圖2所示。誘導前，大腸桿菌本底水平表達了微量的融合蛋白，約占總蛋白的0.5%，當IPTG濃度為0.50、1.00 mmol/L時融合蛋白SUMO-SMAP-29的表達量相對較高，分別占菌體總蛋白的9.99%、10.02%，統(tǒng)計學分析顯示兩者差異不顯著。因此，IPTG濃度在0.50～1.00 mmol/L之間均能相對高效地誘導融合蛋白SUMO-SMAP-29的表達，出于節(jié)約成本考慮，在后續(xù)試驗中選擇0.50 mmol/L IPTG為誘導濃度。

表1 不同IPTG濃度融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.1.2 不同誘導溫度對大腸桿菌表達融合蛋白SUMO-SMAP-29的影響 由圖2可知，在誘導溫度為25、30、37、42 ℃ 時，均能誘導大腸桿菌表達融合蛋白SUMO-SMAP-29。通過Quantity One軟件對融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量進行分析，結(jié)果如表2和圖2所示，當誘導溫度為30、37 ℃時表達量相對較高，分別占菌體總蛋白的10.10%、9.95%，兩者間差異不顯著，因此30～37 ℃均能相對高效地誘導融合蛋白SUMO-SMAP-29的表達，為了降低對恒溫培養(yǎng)箱的損耗，后續(xù)試驗選擇低一點的溫度30 ℃作為誘導溫度。

表2 不同誘導溫度融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量

2.1.3 不同誘導時間對大腸桿菌表達融合蛋白SUMO-SMAP-29的影響 通過Quantity One和SPSS軟件對融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量進行分析，結(jié)果如圖3和表3所示，誘導表達后，融合蛋白SUMO-SMAP-29表達量0～3 h不斷升高，在5 h處表達量達到相對較高的水平，占菌體總蛋白的11.35%；5 h后，融合蛋白SUMO-SMAP-29的表達量反而有所減少。統(tǒng)計學分析顯示，誘導3、5 h的相對表達量差異不顯著，出于節(jié)約時間的考慮，選取3 h作為誘導時間。

2.2 融合蛋白SUMO-SMAP-29的分離純化

在誘導劑IPTG終濃度為0.50mmol/L、誘導溫度為30 ℃、誘導3 h后收集菌液離心。經(jīng)Ni柱親和層析純化后，分別取樣品、樣品流出液、清洗液以及洗脫液用SDS-PAGE電泳分析(圖4)，電泳結(jié)果顯示獲得了融合蛋白SUMO-SMAP-29。

表3 不同誘導時間對融合蛋白SUMO-SMAP-29的相對表達量

3 討論

大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可高效表達外源基因等優(yōu)點，是目前抗菌肽表達采用最多的表達系統(tǒng)?？咕腟MAP-29因本身具有抗菌活性，對宿主菌具有殺傷作用，直接表達較困難。另外，因分子量小和陽離子特性容易被細胞中的蛋白酶降解，目前表達抗菌肽時常采用融合表達。融合表達模擬了抗菌肽在生物機體內(nèi)合成時的前體結(jié)構(gòu)[13]，分子伴侶的作用類似于天然抗菌肽的前體部分。SUMO標簽蛋白能促進目的蛋白的可溶性表達和正確折疊[14]；對熱和蛋白酶有很強的抗性，有利于保持目的蛋白的穩(wěn)定性；SUMO分子量較小，表達融合蛋白中目的蛋白占比例較大，提高目的蛋白得率。

外界條件如IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等對大腸桿菌表達外源蛋白有著十分重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化上述條件能夠獲得更高的表達量，但因表達菌株、質(zhì)粒和外源蛋白的差異，最佳的表達條件也各不相同。

誘導劑IPTG濃度過低時，啟動子沒有完全啟動，大腸桿菌無法最大化分泌外源蛋白；但IPTG濃度過高可能會對大腸桿菌有抑制作用，且IPTG一般價格不便宜，會造成試驗經(jīng)費上的浪費。本試驗通過研究不同IPTG濃度對大腸桿菌表達SUMO-SMAP-29的影響發(fā)現(xiàn)，隨著IPTG濃度的升高，融合蛋白SUMO-SMAP-29表達量增加，當IPTG濃度為 0.50、1.00 mmol/L時融合蛋白SUMO-SMAP-29表達量相對較高，統(tǒng)計分析顯示表達量差異不顯著；但IPTG濃度為 2.00 mmol/L 時，表達量反而下降，這可能與高濃度的IPTG對大腸桿菌有抑制作用相關(guān)，出于成本考慮，在本試驗選擇 0.50 mmol/L IPTG作為誘導濃度。

溫度不僅影響大腸桿菌的生長，也對外源蛋白的穩(wěn)定性有著一定的影響。在溫度相對偏低時，菌體生長速率緩慢，代謝速率較低，外源蛋白表達量偏低。但在另一方面，低溫有助于維持穩(wěn)定外源蛋白的結(jié)構(gòu)，高溫可能會破壞外源蛋白的結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)溫度過高(如42 ℃)時，融合蛋白SUMO-SMAP-29的表達量有所降低。本試驗中發(fā)現(xiàn)誘導溫度為30、 37 ℃ 時，融合蛋白SUMO-SMAP-29表達量相對較高，統(tǒng)計分析顯示30、37 ℃誘導時融合蛋白SUMO-SMAP-29相對表達量之間差異不顯著，為了降低對恒溫培養(yǎng)箱的損耗，本試驗選擇低一點的溫度(30 ℃)作為誘導溫度。

誘導表達時間的優(yōu)化影響著外源蛋白的最終產(chǎn)量。從外源蛋白開始被大腸桿菌表達至培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡的過程中，外源蛋白的表達是一個不斷變化的過程。因為隨著誘導時間的延長，表達的外源蛋白越來越多，但是，外源蛋白也不斷被蛋白酶降解。在本試驗中，大腸桿菌在0～5 h這段時間大量表達融合蛋白SUMO-SMAP-29；5 h后，由于大腸桿菌表達SUMO-SMAP-29的速率下降，低于SUMO-SMAP-29被降解的速率，所以SUMO-SMAP-29開始減少。統(tǒng)計學分析顯示，誘導3、5 h的相對表達量差異不顯著，出于節(jié)約時間的考慮，選取3 h作為誘導時間。

相對于表達載體的構(gòu)建和蛋白的誘導表達，外源蛋白的純化更加困難和繁瑣。Ni柱親和層析是通過蛋白質(zhì)暴露在表面的一些氨基酸殘基(如組氨酸)和樹脂上的金屬離子之間的特異性結(jié)合進行純化目的蛋白的，具有配體簡單、吸附性強、分離條件適宜以及不影響蛋白質(zhì)自身的生物活性等優(yōu)點。融合標簽SUMO自身帶有6×His標簽，因此本試驗利用Ni柱親和層析純化重組融合蛋白SUMO-SMAP-29，且純化效率較好。

本試驗結(jié)果表明，融合蛋白SUMO-SMAP-29相對最優(yōu)的誘導表達條件為IPTG終濃度0.50 mmol/L、誘導溫度 30 ℃、誘導表達時間3 h。這為進一步研究抗菌肽SMAP-29的生物學活性及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了必要的基礎(chǔ)。

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