李 沙，陳 婷，李 歡，俞書義，陳 海，朱 雄

(海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 572000)

萊姆病是一種由蜱叮咬傳播的人獸共患病，其致病病原體為伯氏疏螺旋體。病原體進(jìn)入機(jī)體后早期表現(xiàn)為皮膚游走性紅斑、流感樣癥狀、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、胸痛等癥狀，晚期可表現(xiàn)為面神經(jīng)炎、腦膜炎、面神經(jīng)麻痹、肢體麻木等神經(jīng)系統(tǒng)受損[1-2]。萊姆病已在全球70多個(gè)國(guó)家報(bào)道，分布廣泛。我國(guó)萊姆病主要集中在東北林區(qū)，但南方許多省份也有報(bào)道。有學(xué)者已證實(shí)海南存在萊姆病病原體感染[3]。三亞作為海南省國(guó)際旅游島的中心城市，人口聚集日益上升。海南省大部分1級(jí)或2級(jí)醫(yī)院臨床醫(yī)師對(duì)萊姆病不了解甚至不知道。現(xiàn)探討三亞地區(qū)萊姆病感染情況，為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年3―8月該院因神經(jīng)系統(tǒng)癥狀就診患者的外周靜脈血5 mL，分別編號(hào)和登記，離心分離血清置―20 ℃低溫冰箱保存待檢。

1.2儀器與試劑 羊抗人免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)熒光抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgM和SPA，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PD91菌免疫兔血清、萊姆病抗原片和蛋白免疫印跡法(Western blot)膜條由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所萊姆病室提供。

1.3萊姆病抗體檢測(cè)

1.3.1間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 采用PD91菌株常規(guī)制備抗原片，將血清用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mmol/L，pH 7.2)從1∶16開始倍比稀釋。在熒光顯微鏡40×10視野下，50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價(jià)達(dá)到IgM≥1∶64或IgG≥1∶128者為陽(yáng)性。同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照為PBS，陽(yáng)性對(duì)照為PD91菌免疫兔血清。

1.3.2Western blot 將IFA法初篩的陽(yáng)性標(biāo)本，進(jìn)一步使用Western blot檢測(cè)。應(yīng)用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫5次，每次至少10 min，將抗原條分別加入2抗IgG或IgM，過(guò)夜。再經(jīng)過(guò)洗脫5次，每次至少10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結(jié)束用純水終止反應(yīng)。陰性對(duì)照為PBS-T，陽(yáng)性對(duì)照為PD91菌免疫兔血清。Western blot結(jié)果根據(jù)《中國(guó)萊姆病WB診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判定。

2 結(jié) 果

2.1IFA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用IFA方法對(duì)251例神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者的血清萊姆病抗體進(jìn)行檢測(cè)，熒光顯微高倍鏡下50%視野顯示明亮菌體熒光為陽(yáng)性，其中IgG抗體陽(yáng)性31例，IgM抗體陽(yáng)性14例，IgG和IgM抗體同時(shí)陽(yáng)性3例，陽(yáng)性率16.73%。見(jiàn)圖1和表1。

注：箭頭所指為高倍鏡視野下PD91伯氏疏螺旋體顯示綠色熒光，50%視野顯示菌體熒光為陽(yáng)性

圖1 IFA法檢測(cè)血清萊姆病抗體菌陽(yáng)性(40×10)

2.2Western blot復(fù)檢實(shí)驗(yàn)結(jié)果 251例患者通過(guò)IFA法檢出陽(yáng)性42例，對(duì)42例陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行Western blot復(fù)檢，結(jié)果顯示IgG抗體陽(yáng)性7例，IgM抗體陽(yáng)性5例，IgG和IgM抗體同時(shí)陽(yáng)性2例，感染率為3.98%。見(jiàn)表2。

表1 251例神經(jīng)癥狀患者血清萊姆病IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 42例IFA陽(yáng)性患者的Western blot復(fù)檢結(jié)果

2.3251例患者的神經(jīng)系統(tǒng)臨床表現(xiàn) Western blot復(fù)檢10例萊姆病患者中，面神經(jīng)炎1例，面神經(jīng)麻痹2例，腦實(shí)質(zhì)損害5例，肢體麻木2例等感覺(jué)異常表現(xiàn)。見(jiàn)表3。

表3 251例神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者不同的臨床表現(xiàn)

3 討 論

萊姆病是由伯氏疏螺旋體引起的一種蜱媒螺旋體病，傳播媒介主要是幾種近緣硬蜱，通過(guò)蜱叮咬將病原體傳播人群而發(fā)病[4-5]。該病是一種多系統(tǒng)受損的綜合征，除表現(xiàn)皮膚慢性游走紅斑，心臟受損，關(guān)節(jié)癥狀外，還可出現(xiàn)復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[6]。神經(jīng)系統(tǒng)損害是萊姆病最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)之一，伯氏疏螺旋體具有高度的嗜神經(jīng)性，不僅可引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，還可長(zhǎng)期潛伏中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在不同階段表現(xiàn)出不同的神經(jīng)螺旋體病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。調(diào)查神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者的萊姆病情況，可為臨床提供一個(gè)警示和參考。

自1975年發(fā)現(xiàn)萊姆病以來(lái)，至今世界上已有四大洲、70多個(gè)國(guó)家有該病報(bào)道[7]。我國(guó)于1986年首次在黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)萊姆病[8]。近年來(lái)調(diào)查表明，我國(guó)存在較廣泛的萊姆病自然疫源地?；疾÷瘦^高的地方主要集中在東北三省、內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)、新疆天山、長(zhǎng)江中上游山林地區(qū)。南方地區(qū)如湖南、湖北、福建等地都報(bào)道了該病的存在。海南省作為中國(guó)最南端的省份，在2011年就有學(xué)者報(bào)道了蜱感染疾病[9]。2015年也有學(xué)者對(duì)海南省關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)癥狀患者進(jìn)行血清萊姆病伯氏疏螺旋體抗體篩查，采用IFA法篩查，進(jìn)一步使用Western blot確證，然后對(duì)陽(yáng)性患者血清提取DNA和PCR，產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序分析，確證海南省存在萊姆病[3]。本研究調(diào)查三亞地區(qū)251例神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者的萊姆病情況，結(jié)果顯示IFA法初篩陽(yáng)性率為16.73%，Western blot確證感染萊姆病10例，感染率3.98%，表明三亞地區(qū)存在神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的萊姆病患者，提示臨床對(duì)該類患者應(yīng)考慮是否患萊姆病。

本研究結(jié)果表明，IFA法檢測(cè)251例血清萊姆病抗體，初篩陽(yáng)性率為16.93%，而Western blot檢測(cè)陽(yáng)性率為3.98%，IFA法陽(yáng)性率高于Western blot的原因是，IFA法與鉤端螺旋體、梅毒螺旋體有交叉反應(yīng)，而Western blot抗原膜片為伯氏疏螺旋體的特異性抗原。有學(xué)者通過(guò)IFA法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分析827例疑似萊姆病患者的血清伯氏疏螺旋體抗體發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性135例，陽(yáng)性率16.32%，其中神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者344例，陽(yáng)性88例，陽(yáng)性率為25.6%[10]。如果通過(guò)Western blot檢測(cè)患者血清存在伯氏疏螺旋體抗體，再結(jié)合臨床癥狀和蜱叮咬史，基本可以確診患有萊姆病。

本研究認(rèn)為三亞地區(qū)存在萊姆病，可為臨床提供參考。據(jù)三亞市國(guó)土環(huán)境資源局的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年三亞的森林覆蓋率達(dá)68%，當(dāng)?shù)卮嬖诖罅苛謪^(qū)工人和護(hù)林人員，林區(qū)作業(yè)者是萊姆病易感人群，感染源為含有伯氏疏螺旋體的蜱，通過(guò)叮咬傳播。本研究下一步目標(biāo)將根據(jù)患者的住所和作業(yè)環(huán)境溯源，捕捉當(dāng)?shù)氐尿?，進(jìn)行病原學(xué)培養(yǎng)。若能成功培養(yǎng)伯氏疏螺旋體，將成為該地區(qū)是萊姆病自然疫源地的直接證據(jù)。

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