牛 翠，黃紅革，馬 芳，薛 云，董月穩(wěn)，時(shí)東彥△

(1.河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科 054000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000)

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，特別是耐碳青霉烯類的鮑曼不動(dòng)桿菌的報(bào)道越來(lái)越多，其在院內(nèi)導(dǎo)致致死性感染，如呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、敗血癥、腦膜炎等[1-2]。為指導(dǎo)臨床及時(shí)對(duì)感染多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌患者選擇有效的抗菌藥物，現(xiàn)探討應(yīng)用CarbAcineto NP方法(改良CarbaAcineto NP實(shí)驗(yàn))，檢測(cè)耐碳青霉烯酶的不動(dòng)桿菌屬。

1 材料與方法

1.1一般材料 選擇邢臺(tái)市第三醫(yī)院2015年1月至2016年1月從臨床標(biāo)本分離所得的非重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌株，共80株，所有菌株用無(wú)菌紙片―20 ℃低溫保存，采用VITEK COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌藥敏鑒定儀進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-17056，大腸埃希菌ATCC 25922，均來(lái)源于原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器與試劑 VITEK COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；Gene Amp PCR System 2400熱循環(huán)儀(美國(guó)Applied Biosystems Inc.)； ID Scientific 自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Kodak Inc.)。Premix Taq酶(大連Takara公司)；DNA Marker DL 2000(大連Takara公司)；瓊脂糖(美國(guó)Hydra Gene公司)；Goldviw顯影液(北京賽百盛生物技術(shù)公司)；氯化鈉(純度：≥99.5%)(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；硫酸鋅(ZnSO4·7H2O≥99.5%)，苯酚紅 (天津永大化學(xué)試劑有限公司)；亞胺培南西司他丁鈉(杭州默沙東制藥有限公司)。

1.3菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 80株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行純培養(yǎng)，運(yùn)用VITEK COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照2015年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌的耐藥情況。

1.4碳青霉烯酶OXA-23基因檢測(cè) 采用煮沸法在滅菌蒸餾水中加入數(shù)個(gè)菌落，100 ℃水中煮沸10 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，上清液作為PCR模板。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，OXA-23-F：5′GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA；OXA-23-R：5′ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT。目的片段501 bp，反應(yīng)體系25 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 2 min,循環(huán)參數(shù)：變性95 ℃ 30 s;退火溫度52 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 1 min;延伸72 ℃ 10 min,共循環(huán)30次 。 取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%含Goldview染料的瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外成像儀上成像并記錄結(jié)果。

1.5CarbAcineto NP方法 參照CLSI M100-S25，采用5 mol/L NaCl替代Tris-HCL[3]。取1環(huán)(10 μL)在血瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌，加入含100 μL 5 mol/L NaCl管中振蕩混勻。每株菌分別加入2個(gè)EP管中，分別設(shè)置為A管(對(duì)照管)和B管(試驗(yàn)管)。A管中加入100 μL酚紅硫酸鋅溶液(pH值7.8);B管中加入100 μL含12 mg/mL亞胺培南西司他丁鈉的酚紅硫酸鋅溶液(pH值7.8)，35 ℃溫育2 h后觀察結(jié)果。CarbAcineto NP結(jié)果判讀:(1)A管和B管都為紅色或紅-橙色，結(jié)果為陰性(非碳青霉烯酶產(chǎn)生株)。(2)A管為紅色或紅-橙色，B管為黃色、深黃色或淺橙色，結(jié)果為陽(yáng)性(碳青霉烯酶產(chǎn)生株)。(3)若A管為深黃色、黃色、淺橙色或橙色，B管為任何顏色，則結(jié)果判為無(wú)效。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706和ATCC BAA-1705分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，使用配對(duì)χ2檢驗(yàn)中McNemar檢驗(yàn)對(duì)OXA-23和CarbAcineto NP的陽(yáng)性率進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性分析 80株鮑曼不動(dòng)桿菌中49株細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥，31株對(duì)碳青霉烯類藥物敏感。

2.2PCR檢測(cè)OXA-23基因結(jié)果分析 耐碳青霉烯類的49株鮑曼不動(dòng)桿菌中，有47株攜帶OXA-23基因，攜帶率為95.9%。見(jiàn)圖1。

注：N表示陰性對(duì)照；P表示陽(yáng)性對(duì)照；M表示標(biāo)記物

圖1 OXA-23基因的PCR檢測(cè)

2.3CarbAcineto NP檢測(cè)結(jié)果分析 耐碳青霉烯類的49株鮑曼不動(dòng)桿菌中，43株菌CarbAcineto NP方法檢測(cè)為陽(yáng)性。31株對(duì)碳青霉烯類敏感株中有30株菌CarbAcineto NP檢測(cè)為陰性。見(jiàn)表1。

表1 OXA-23和CarbAcineto NP的檢測(cè)結(jié)果和耐藥性

2.4CarbAcineto NP與PCR的檢測(cè)結(jié)果比較 與PCR比較，CarbAcineto NP方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為87.8%(43/49)，陰性預(yù)測(cè)值為96.7%(30/31)。見(jiàn)表2。

表2 CarbAcineto NP和PCR的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，80株鮑曼不動(dòng)桿菌中49株菌對(duì)碳青霉烯類耐藥，耐藥率為61.3%，47株攜帶OXA-23基因，攜帶率為95.9%，該院耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的主要基因型為OXA-23型。較多研究報(bào)道此類鮑曼不動(dòng)桿菌的基因型為OXA-23[4-6]。本研究2株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類敏感且攜帶OXA-23基因，可能原因?yàn)檫@2株細(xì)菌無(wú)ISAbal提供的強(qiáng)啟動(dòng)子，無(wú)法使OXA-23表達(dá)量增加，但需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[7-8]。

Carba NP方法原理是細(xì)菌可水解亞胺培南藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán)，然后通過(guò)酚紅的顏色變化進(jìn)行驗(yàn)證[9]。腸桿菌和綠膿桿菌所產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶和KPC酶通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明有較高的敏感性(>90%)和特異性(>90%)，然而傳統(tǒng)的CarbaAcineto NP方法很難檢測(cè)出不動(dòng)桿菌屬的碳青霉烯酶，是由于不動(dòng)桿菌屬產(chǎn)生了較弱的OXA型D類碳青霉烯酶。因此，DORTET等[9]建立一種CarbAcineto NP方法(改良的Carba NP實(shí)驗(yàn))檢測(cè)不動(dòng)桿菌屬的碳青霉烯酶。CarbAcineto NP方法由于挑取的菌株量較CarbaAcineto NP方法增加2倍，因此增加了酶的釋放量，且使用5 mol/L NaCl高滲溶液不會(huì)像蛋白抽提液(Tris-HCl)會(huì)對(duì)溶液導(dǎo)致輕微的pH值的改變，更容易使細(xì)菌蛋白得到完全釋放。 本研究有2株耐碳青霉稀類藥物的菌株在CarbAcineto NP和PCR方法檢測(cè)為陰性，由于鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類藥物的機(jī)制有很多(如細(xì)菌外膜通透性)下降；外排泵高表達(dá)；產(chǎn)碳青霉烯酶A類(KPC、GES型)、B類(IMP、VIM、SIM、NDM型)、D類(OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143、OXA-235型)[10-12]。由于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法有限，這2株細(xì)菌的耐藥機(jī)制還需進(jìn)一步檢測(cè)。

2株對(duì)碳青霉烯類敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)CarbAcineto NP方法檢測(cè)呈陰性，OXA-23基因呈陽(yáng)性，原因可能是OXA-23基因表達(dá)的碳青霉烯酶活性較弱，無(wú)ISAbal提供的強(qiáng)啟動(dòng)子，致使未對(duì)碳青霉烯類耐藥，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

DORTET等[9]應(yīng)用CarbAcineto NP方法對(duì)151株產(chǎn)碳青霉烯酶和69株不產(chǎn)碳青霉烯酶的不動(dòng)桿菌屬進(jìn)行檢測(cè)，除GES型外，所有為后天獲得的碳青霉烯酶基因型。如果由于OXA-51固有基因過(guò)度表達(dá)或由非碳青霉烯酶機(jī)制導(dǎo)致，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然陰性，其敏感性和特異性分別達(dá)94.7%和100.0%。而本實(shí)驗(yàn)CarbAcineto NP方法的敏感性和特異性分別達(dá)87.8%和96.2%，與PCR方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CarbAcineto NP方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，試劑易于配置，價(jià)格低廉，耗時(shí)較短，結(jié)果易于觀察，在臨床實(shí)驗(yàn)室可很好地開(kāi)展，是檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的鮑曼不動(dòng)桿菌的快速檢測(cè)方法。

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