劉 芳，陳 端

(1.湖北省黃石市結(jié)核病防治院 435000；2.湖北省黃石市臨床檢驗(yàn)中心 435000)

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種常見的慢性炎性疾病，與遺傳過(guò)敏體質(zhì)有關(guān)，以皮膚干燥、脫屑、瘙癢為主要表現(xiàn)，易診難治，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。該病病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為AD的發(fā)生與免疫調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)，其中CD4+T淋巴細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中備受關(guān)注。有研究報(bào)道AD患者皮損中浸潤(rùn)的大量炎性細(xì)胞主要為CD4+T淋巴細(xì)胞[1]。濾泡性輔助性T(Tfh)細(xì)胞是一種新型CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，與其他T淋巴細(xì)胞亞群功能不同，主要為促進(jìn)和誘導(dǎo)B細(xì)胞的成熟和分化[2]。該細(xì)胞具有其獨(dú)特的免疫表型，可高表達(dá)CXC趨化因子受體5(CXCR5)、誘導(dǎo)性共刺激分子(ICOS)、程序性死亡受體-1(PD-1)、B細(xì)胞淋巴瘤-6(Bcl-6)、白細(xì)胞介素-21(IL-21)，其中ICOS、PD-1的表達(dá)對(duì)Tfh細(xì)胞的功能具有重要的作用[3]。但Tfh細(xì)胞在AD患者中的特征及意義尚不清楚?，F(xiàn)探討AD患者外周血Tfh細(xì)胞的表達(dá)特征，為闡明AD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 20例AD患者全部來(lái)自2015年6月至2016年7月該院門診的就診患者(AD組)，符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)，男12例，女8例，年齡12～31歲，平均年齡(20.13±5.01)歲；病程11～30年，平均病程(17.46±7.78)年。所有患者入組前1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療，近1周內(nèi)未口服抗組胺藥及外用糖皮質(zhì)激素，均未合并腫瘤及其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病。采用歐洲特應(yīng)性皮炎評(píng)分系統(tǒng)(SCORAD)評(píng)估病情嚴(yán)重程度。進(jìn)行為期1個(gè)月隨訪，隨訪期間所有患者均采用中藥湯劑口服和他克莫司軟膏外用治療。健康對(duì)照者(健康對(duì)照組)為12例健康志愿者，男7例，女5例，年齡14～30歲，平均年齡(22.52±4.75)歲。2組研究對(duì)象的年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 小鼠抗人CD4-Percp抗體、小鼠抗人CXCR5-FITC抗體、小鼠抗人ICOS-PE抗體、小鼠抗人PD-1-APC抗體，F(xiàn)ACSCalibura流式細(xì)胞儀、溶血素均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3方法 2組研究對(duì)象治療前和治療1個(gè)月后均于清晨空腹采取外周靜脈血3 mL，肝素鋰抗凝。取全血200 μL依次加入抗體：Percp-anti-CD4 6 μL，F(xiàn)ITC-anti-CXCR5 4 μL，APC-anti-PD-1 5 μL，PE-anti-ICOS 5 μL，4 ℃避光孵育30 min，然后加入溶血素2 mL，震蕩混勻，室溫避光5 min，離心去上清液后再加入2 mL PBS洗滌1次，最后加入150 μL 4%多聚甲醛固定，4 ℃保存。標(biāo)本于24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1AD組患者外周血Tfh細(xì)胞特征 AD組患者外周血Tfh細(xì)胞頻率明顯高于健康對(duì)照組[(10.29±1.87)%vs. (14.01±2.73)%,P<0.01)]。與健康對(duì)照組比較，AD組患者外周血Tfh細(xì)胞表面PD-1和ICOS的表達(dá)也明顯升高[(0.45±0.16)%vs. (0.64±0.17)%,P<0.05；(0.33±0.08)%vs. (0.45±0.11)%,P<0.01]。見圖1。

注：A表示外周血Tfh細(xì)胞頻率；B表示外周血Tfh細(xì)胞表面PD-1表達(dá)；C表示Tfh細(xì)胞表面ICOS表達(dá)

圖1 AD組患者外周血Tfh細(xì)胞特征

2.2AD組患者Tfh細(xì)胞與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性 AD組患者外周血Tfh細(xì)胞頻率與SCORAD評(píng)分呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.54，P=0.01);Tfh細(xì)胞表面PD-1和ICOS表達(dá)水平與SCORAD評(píng)分具有正相關(guān)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.43，P=0.06；r=0.27，P=0.25)。見圖2。

注：A表示外周血Tfh細(xì)胞頻率與SCORAD評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系；B表示PD-1表達(dá)水平與SCORAD評(píng)分具有正相關(guān)趨勢(shì)；C表示ICOS表達(dá)水平與SCORAD評(píng)分具有正相關(guān)趨勢(shì)

圖2 AD組患者Tfh細(xì)胞與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

2.3AD組患者治療前后Tfh細(xì)胞頻率及功能的變化 AD組患者采用中藥湯劑口服和他克莫司軟膏外用治療，時(shí)間為1個(gè)月。治療后皮疹及瘙癢減輕，且外周血Tfh細(xì)胞頻率較治療前明顯降低[(14.01±2.73)%vs. (11.61±2.98)%,P<0.05]。與治療前比較，AD患者外周血Tfh細(xì)胞PD-1和ICOS表達(dá)也明顯降低[(0.63±0.17)%vs. (0.51±0.21)%,P<0.05；(0.45±0.11)%vs. (0.38±0.15)%,P<0.05]。見圖3。

注：A表示外周血Tfh細(xì)胞頻率較治療前降低；B表示外周血Tfh細(xì)胞PD-1表達(dá)降低；C表示外周血Tfh細(xì)胞ICOS表達(dá)降低

圖3 AD組患者治療前后Tfh細(xì)胞頻率及功能的變化

3 討 論

AD是一種常見的慢性瘙癢性皮膚病，在發(fā)展中國(guó)家約為10%～20%兒童患有AD，是最常見的皮膚病。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為該病是由環(huán)境和基因等多種因素相互作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂和皮膚屏障受損而引起的變態(tài)反應(yīng)性皮膚病。既往研究表明，AD患者皮損中Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子均明顯升高，因此認(rèn)為AD主要是由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病[4]。隨著新型CD4+T細(xì)胞亞群的不斷出現(xiàn)及對(duì)AD免疫發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，近期研究報(bào)道Th17、Th22、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等細(xì)胞亞群在AD的發(fā)病機(jī)制中均具有重要作用[5-7]。Tfh細(xì)胞是一種新型CD4+T細(xì)胞亞群，起重要的免疫作用，參與多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展。

Tfh細(xì)胞最初發(fā)現(xiàn)于淋巴生發(fā)中心，主要功能為促進(jìn)生發(fā)中心的成熟、誘導(dǎo)B細(xì)胞分化及促進(jìn)抗體的產(chǎn)生[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外周血同樣存在Tfh細(xì)胞，其與存在于生發(fā)中心的Tfh細(xì)胞具有相似的免疫表型及功能[8]。目前常用CXCR5+ CD4+T細(xì)胞定義外周血Tfh細(xì)胞。許多研究顯示，多種免疫相關(guān)性疾病中存在Tfh細(xì)胞含量的改變和功能的紊亂，如Henoch-Schnlein紫癜、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等[9-11]。本研究結(jié)果表明，AD組患者外周血Tfh細(xì)胞頻率較健康對(duì)照組顯著升高，提示Tfh細(xì)胞在AD的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。Tfh細(xì)胞表面分子ICOS的表達(dá)對(duì)Tfh細(xì)胞產(chǎn)生重要作用，可調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞的分化和功能[12]。PD-1是Tfh細(xì)胞另一個(gè)重要的表面分子，對(duì)Tfh細(xì)胞的活化具有重要的作用[13]。本研究結(jié)果顯示，AD組患者Tfh細(xì)胞表面PD-1、ICOS表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明AD患者Tfh細(xì)胞不僅含量升高功能也處于活化狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，Tfh細(xì)胞頻率與SCORAD評(píng)分呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，而Tfh細(xì)胞表面PD-1和ICOS表達(dá)水平與SCORAD評(píng)分具有正相關(guān)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與患者標(biāo)本數(shù)較少有關(guān)，因此需大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證Tfh細(xì)胞表面PD-1和ICOS的表達(dá)水平與SCORAD評(píng)分的相關(guān)性。治療1個(gè)月后，AD患者皮疹好轉(zhuǎn)，瘙癢減輕，外周血Tfh細(xì)胞頻率降低，且功能性分子PD-1、ICOS表達(dá)水平也顯著降低，說(shuō)明Tfh細(xì)胞可能與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

綜上所述，AD患者Tfh細(xì)胞不僅頻率升高且功能處于活化狀態(tài)，治療后疾病減輕，外周血Tfh細(xì)胞頻率也降低，功能性分子PD-1、ICOS的表達(dá)水平也降低。本研究結(jié)果提示Tfh細(xì)胞在AD發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用，為闡明AD發(fā)病機(jī)制提供新的思路，為治療AD提供新型的生物靶點(diǎn)。

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