趙宇明,張 悅,王 華,田 寶,郭冬梅

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院 066000)

前列腺癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)于老年患者，且病死率較高，是目前導(dǎo)致男性癌癥病死的主要原因之一[1-2]。隨著我國(guó)老齡化的不斷加重，前列腺癌患者的發(fā)病率也持續(xù)增高，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，如何控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散并提高腫瘤治療的效果，對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要的臨床意義[3-4]。多項(xiàng)研究表明，微小RNA(miRNA)可能在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域起重要作用，而多種miRNA 均參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程[5-6]。為了進(jìn)一步探討miR-135a與前列腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT6)的相關(guān)性，現(xiàn)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-135a序列和空白序列后的細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞周期、遷移和侵襲能力，以及p-STAT6和STAT6蛋白表達(dá)、miR-135a表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)分析，為臨床提供一定的治療理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 人激素非依賴前列腺癌細(xì)胞株DUl45購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2儀器與試劑 (1)HR22型高速冷凍離心機(jī)(日本日立)，F(xiàn)S-7900型PCR儀 (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)， Gel Doc 1000UV型分子定量成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)， Napco-541型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó))，IX70型倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，880型酶標(biāo)儀(德國(guó)拜發(fā))。(2)胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、F12K-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自美國(guó)Gibco公司；Mature miRNA-135a和miRNA Negative Control(NC)均購自上海吉瑪公司； Trizol提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國(guó)Epitomics公司；脂質(zhì)體(Lipofectamine)2000 購自Invitrogen 公司。CCK-8 試劑盒購自碧云天試劑公司；侵襲(Transwell) 小室購自美國(guó)Coring 公司；鼠抗人STAT6、p-STAT6 1抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、抗鼠2抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國(guó)Bio Sharp公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) DU145細(xì)胞株采用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素雙抗的F12K-DMEM培養(yǎng)基,在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞株接種于6孔培養(yǎng)板中，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合后利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染has-miR135a序列(miR-135a轉(zhuǎn)染組)及NC序列(空白轉(zhuǎn)染組)，轉(zhuǎn)染終濃度為50 mmol/L，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染結(jié)束后加培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)48 h。

1.3.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別于轉(zhuǎn)染48 h后取各組細(xì)胞懸液利用胰蛋白酶進(jìn)行消化，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并于培養(yǎng)0、24、48 h時(shí)取各組細(xì)胞懸液加入MTT (5 mg/mL)孵育4 h，隨后加入DMSO進(jìn)行溶解并沉淀，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值(A)，觀察各組細(xì)胞增殖情況，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 分別于轉(zhuǎn)染48 h后取各組細(xì)胞懸液，應(yīng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化，1 000 r/min離心15 min后收集細(xì)胞沉淀，以PBS洗滌2次加入預(yù)冷75%乙醇在―20 ℃條件下固定24 h，1 000 r/min離心15 min棄上清液，最后加入500 μL細(xì)胞周期固定液重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.3.5Transwell細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 先以無血清培養(yǎng)基37 ℃潤(rùn)濕Transwell小室2 h，將轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞采用胰酶消化后計(jì)數(shù)，選取1×106個(gè)細(xì)胞以無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行重懸并接種于上室，下室中僅加入10%的完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。取出濾膜后以10%多聚甲醛固定，蘇木紅染色在光鏡下觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取其均值代表遷移力量值。

1.3.6蛋白免疫印跡法(Western blot)實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞，洗去培養(yǎng)基后提取總蛋白，并取約75 μg以10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離后轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；加入STAT6和p-STAT6 1抗后4 ℃孵育過夜，0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入LRH標(biāo)記的2抗進(jìn)行反應(yīng)，0.5%TBS-T溶液洗膜3次，使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，并采用軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度比值。

1.3.7RT-PCR實(shí)驗(yàn) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，采用Trizol提取試劑盒提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為DNA，在聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為上游：5′-CCG ACG CGT TCT TTT CTG TTG CCC CAT C-3′；下游：5′-CCC AAG CTT GGA CCG CAG CAC CTA TCT-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min后以95 ℃15 s 變性、60 ℃、60 s 退火、72 ℃ 5 min 30 s延伸，此為1個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，電泳后進(jìn)行RT-CPR測(cè)定，獲得miR-135a的表達(dá)水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.12組轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞的miR-135a表達(dá)結(jié)果比較 轉(zhuǎn)染后48 h，miR-135a轉(zhuǎn)染組miR-135a相對(duì)表達(dá)量為(0.932±0.061)，明顯高于空白轉(zhuǎn)染組(0.023±0.002)(t=36.482，P<0.05)。

2.22組miR-135a對(duì)DU145細(xì)胞的增殖能力結(jié)果比較 miR-135a轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24、48 h的OD值分別為(0.210±0.045)、(0.281±0.052)，明顯低于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見表1。

表1 2組DU145細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)OD值結(jié)果比較

2.32組miR-135a對(duì)DU145細(xì)胞周期影響的結(jié)果比較 miR-135a轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例為(60.02±6.39)%，明顯高于空白轉(zhuǎn)染組(45.34±7.22)%(t=3.730，P<0.05)。

表2 2組DU145細(xì)胞遷移和侵襲的結(jié)果比較

圖1 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲圖

2.42組miR-135a對(duì)DU145細(xì)胞遷移和侵襲的結(jié)果比較 miR-135a轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(116.93±30.02)個(gè)和(133.02±28.51)個(gè)，明顯低于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見表2和圖1。

2.52組miR-135a對(duì)DU145細(xì)胞STAT6表達(dá)影響的結(jié)果比較 miR-135a轉(zhuǎn)染組p-STAT6和STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.947±0.114)和(0.437±0.077)，明顯低于空白轉(zhuǎn)染組[(1.320±0.104)和(0.783±0.095)](t=-5.757、-6.931，P<0.05)。見圖2。

注：1表示 miR-135a轉(zhuǎn)染組；2表示空白轉(zhuǎn)染組

圖2 Western blot檢測(cè)圖

3 討 論

前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，包括腺癌、導(dǎo)管腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌等，其中前列腺癌占95%以上[7-8]。隨我國(guó)老齡化人口的加重，前列腺癌的發(fā)病率也逐漸上升，其病死率較高，現(xiàn)已成為危害男性健康的首位腫瘤[9]。前列腺癌的具體發(fā)病原因和機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為與遺傳因素有關(guān)；且前列腺癌多侵襲膀胱、精囊、血管神經(jīng)束等，并可通過盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移引起雙下肢水腫，部分患者還會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，給臨床治療造成難度[10-11]。miRNA是一類重要的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子，可調(diào)控細(xì)胞生物的發(fā)育、增殖、分化、代謝、凋亡、應(yīng)激等過程，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解和翻譯抑制[12]。越來越多的研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程密切相關(guān)，但目前對(duì)于miRNA在前列腺癌中的發(fā)病機(jī)制研究較少[13]。miR-135a是miR-135家族的重要成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用，其在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。有研究報(bào)道，miR-135a促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用是通過對(duì)JAK2(Janus kinase 2)及相關(guān)通路(JA-STAT)的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)，但具體機(jī)制仍需作進(jìn)一步的研究[14]。

本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后miR-135a轉(zhuǎn)染組miR-135a相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，提示miR-135a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-135a明顯高表達(dá)。通過MTT檢測(cè)細(xì)胞增長(zhǎng)率發(fā)現(xiàn)，miR-135a轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24、48 h的OD值明顯低于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，提示miR-10a高表達(dá)可抑制腫瘤的增長(zhǎng)。通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期顯示，miR-135a轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例為明顯高于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，說明miR-135a可顯著地阻滯DU145細(xì)胞周期，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)。侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-135a轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)分別明顯低于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，提示miR-135a與前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移高度相關(guān)，其高表達(dá)可抑制細(xì)胞的侵襲和遷移，但其具體機(jī)制仍需作進(jìn)一步的深入研究。

STAT6是一種相對(duì)分子質(zhì)量約為94×103的蛋白質(zhì)，屬于STAT家族，可通過JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的活化，進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。有研究報(bào)道，STAT6是miR-135a的潛在靶基因，可能與miR-135a抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等機(jī)制有關(guān)，與本研究的研究結(jié)果基本一致[15]。本研究結(jié)果表明，miR-135a轉(zhuǎn)染組p-STAT6和STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，說明miR-135a高表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞STAT6蛋白的表達(dá)，而這可能是miR-135a抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的機(jī)制之一，但具體機(jī)制仍需作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，miR-135a可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的能力，可能與其抑制前列腺癌細(xì)胞STAT6表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]GUZEL E,KARATAS O F,SENERCIOZ A,et al.Identification of microRNAs differentially expressed in prostatic secretions of patients with prostate cancer[J].Internat J Cancer,2015,136(4):875-879.

[2]YAM L T,WINKLER C F,JANCKILA A J,et al.Prostatic cancer presenting as metastatic adenocarcinoma of undetermined origin.Immunodiagnosis by prostatic acid phosphatase[J].Cancer,2008,51(2):283-287.

[3]褚英，沈碧玉．前列腺癌睪丸切除患者圍術(shù)期的常見護(hù)理問題與對(duì)策[J]．實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2015，19(18)：164-165．

[4]曾蜀雄，林建水，許傳亮，等．晚期前列腺癌治療及其基因分型研究進(jìn)展[J]．中華泌尿外科雜志，2015，26(6)：478-480．

[5]閆巖，張春妮．微小核糖核酸與腎細(xì)胞癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24(1)：145-148．

[6]蘭敏．miR-370在腫瘤中的作用及其機(jī)制[J]．中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2016，23(2)：291-296．

[7]QUINN D I,SHORE N D,EGAWA S,et al.Immunotherapy for castration-resistant prostate cancer:progress and new paradigms[J].Urol Oncol,2015,33(5):245-260.

[8]姜辰一,俞俊杰,阮淵,等.LMO2蛋白在前列腺基質(zhì)細(xì)胞中介導(dǎo)的IL-11、FGF-9旁分泌促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲[J].中國(guó)癌癥雜志,2016,26(11):894-901.

[9]吳敏，趙紅光，李英華，等．PET-CT 在前列腺癌診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀和展望[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015，19(3)：513-516．

[10]聶曉楓，王增利．腹腔鏡下腹膜外保留血管神經(jīng)束前列腺癌根治術(shù)對(duì)患者排尿及性功能的影響[J]．中國(guó)性科學(xué)，2016，25(12)：14-17．

[11]朱寅杰，王艷青，潘家驊，等．前列腺癌根治標(biāo)本提示神經(jīng)周圍侵犯對(duì)預(yù)測(cè)前列腺癌進(jìn)展和預(yù)后的價(jià)值[J]．中華外科雜志，2016，54(3)：217-221．

[12]張婷．miRNA-101在腫瘤中的研究進(jìn)展[J]．腫瘤預(yù)防與治療，2016，29(6)：339-342．

[13]云林，唐煥文．MicroRNA-124對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展影響研究進(jìn)展[J]．中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)，2016，43(2)：227-229．

[14]趙宇明．miR-135a通過抑制STAT6表達(dá)及其磷酸化調(diào)控激素非依賴前列腺癌細(xì)胞增殖的研究[D]．南京：東南大學(xué)，2013．

[15]張彥兵，王妍華，郭亞煥，等．miR-135b促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31(10)：1316-1321．