陳熙， 王斌， 羅旭*

(1.西南林業(yè)大學(xué)，西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650224； 2. 云南高黎貢山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)瀘水管護(hù)分局，云南瀘水673100)

白腹鷺Ardeainsignis隸屬于鷺科Ardeidae鷺屬Ardea(Gill & Donsker，2014)，是一種體型較大的涉禽，高達(dá)127 cm，整體呈灰色，分布于尼泊爾、不丹、印度東北部和緬甸北部，我國云南西部(Hoyoetal. ，1992；韓聯(lián)憲等，2015)。自1994年，白腹鷺被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為瀕危(EN)物種，后升級(jí)為極危(CR) 物種，全球數(shù)量不足500只(IUCN，2016)。在《中國脊椎動(dòng)物紅色名錄》中，白腹鷺的現(xiàn)狀是缺乏數(shù)據(jù)(DD)(蔣志剛等，2016)。對(duì)于該物種，不論是野外分布、種群現(xiàn)狀，還是系統(tǒng)分類、分子生物學(xué)研究，均近于空白。

關(guān)于鷺類的系統(tǒng)分類研究歷來不多，或者分類取樣十分有限(張保衛(wèi)等，2002；常青等，2003；張國萍等，2005)。鷺屬內(nèi)的物種歸屬也一直存在爭議。比如，大白鷺A.alba和中白鷺A.intermedia長期以來被置于白鷺屬Egretta(鄭作新，1964，1994；Hermannetal. ，1972；Benetal. ，1975)，但Sibley和Monoroe(1990)根據(jù)DNA雜交研究結(jié)果，將大白鷺歸入大白鷺屬Casmerodius，中白鷺則獨(dú)立成中白鷺屬M(fèi)esophoyx。但在國際鳥類聯(lián)合會(huì)(International Ornithologists Committee，IOC)的鳥類名錄和目前國內(nèi)普遍采用的鳥類分類系統(tǒng)中，大白鷺和中白鷺都置于鷺屬(鄭光美，2017)。對(duì)于白腹鷺，由于缺乏研究，中國鳥類分類系統(tǒng)一直沿用Peters的分類方式，將其置于鷺屬(Peters，1945；鄭作新，1964；鄭光美，2017)，但尚無分子系統(tǒng)學(xué)的驗(yàn)證。

本研究根據(jù)IOC的分類系統(tǒng)，對(duì)鷺屬鳥類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。分子標(biāo)記采用線粒體DNA中的細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cyt b)基因和細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)基因，它們都被廣泛運(yùn)用于鳥類分類與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究(Mindell，1997；Weibel & Moore，2002；Hebertetal. ，2004；Webb & Moore，2005)。選擇鷺屬內(nèi)7種作為內(nèi)群，選擇鷺科中與鷺屬親緣關(guān)系近且有相應(yīng)基因序列信息的其他6屬7種作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1 材料和方法

1.1 材料

2014年，在云南瀘水發(fā)現(xiàn)的1只白腹鷺是該物種在中國分布的第一條確切記錄(韓聯(lián)憲等，2015)。該個(gè)體于云南野生動(dòng)物園進(jìn)行救助，飼養(yǎng)過程中死亡，我們獲得少量實(shí)驗(yàn)樣品。其余物種的Cytb和COⅠ基因序列均來自美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(表1)。

表1 鷺科14種鳥類基因序列信息Table 1 List and gene information of 14 Ardeidae species

1.2 總DNA提取及基因擴(kuò)增

取-80 ℃保存的肌肉樣品提取DNA。具體操作參考生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式動(dòng)物細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒中使用說明書的標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟。提取DNA后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察提取結(jié)果，若出現(xiàn)明顯條帶且與目的條帶長度相近，則說明已成功提取出樣品的總DNA，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系為25 μL：5 μL DNA模板+12.5 μL Mix+5.5 μL ddH2O+2 μL引物(上下游引物各1 μL)，其中DNA模板和引物的密度均為10-5mol·L-1。反應(yīng)在Applied Biosystems型PCR儀中進(jìn)行。COⅠ基因片段擴(kuò)增選用的引物對(duì)為BirdF1(TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC)和BirdR1(ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG)(Kerretal. ，2007)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。Cytb基因片段擴(kuò)增選用的引物對(duì)為H16067(AGCCTTCAATCTTTGGCTTACAAG)和L14731(AATTGCATCCCACTTAATCGA)(Saetreetal. ，2001)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min， 72 ℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。在凝膠成像儀下確認(rèn)PCR產(chǎn)物是目標(biāo)條帶后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 DNA序列數(shù)據(jù)整理及分析

將測序結(jié)果用SEQMAN進(jìn)行拼接并輔以人工校正。結(jié)合序列圖(abI格式文件)，剪去兩端信號(hào)較雜亂的序列，再查看2條鏈的重疊區(qū)，即在序列的內(nèi)部進(jìn)行人工校正。一般情況下，為保證序列的準(zhǔn)確性，重疊區(qū)域的堿基至少≥50 bp(黃原，1998)。將拼接校正過的DNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST相似性搜索，以確保獲得的序列為目的基因片段。

運(yùn)用Clustal W(Thompsonetal. ，1997)將所有物種的序列進(jìn)行比對(duì)，再運(yùn)用MEGA6.0對(duì)已經(jīng)比對(duì)好的序列計(jì)算堿基組成情況、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)等，用Kimura 2-parameter(K2P)法計(jì)算遺傳距離。選取除鷺屬之外的其他6屬7種為外群，將2段基因合并，應(yīng)用MrBayes3.1(Huelsenbeck & Ronquist，2003)構(gòu)建貝葉斯樹，運(yùn)行4個(gè)馬爾可夫鏈，共運(yùn)行5 000 000代，至平均標(biāo)準(zhǔn)離差(sd)=0.004 315(只有當(dāng)sd<0.01時(shí)說明達(dá)到收斂，才可結(jié)束運(yùn)行)。在FigTree 1.4.2中查看和修飾系統(tǒng)樹。

2 研究結(jié)果

2.1 白腹鷺基因序列特征

白腹鷺Cytb基因序列共有1 163個(gè)位點(diǎn)(表2)。堿基含量中G最高，C最低，A+T(51.7%)高于G+C(48.3%)。嘧啶含量(39.7%)明顯低于嘌呤含量(60.3%)。第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)的A+T均高于G+C，第三位點(diǎn)的A+T(48.0%)低于G+C(52.0%)。在密碼子的不同位點(diǎn)，堿基頻率有不同偏倚，第二位點(diǎn)上4種堿基含量較接近，偏倚程度最?。坏谌稽c(diǎn)上G含量增加到46.8%，C含量只有5.2%，偏倚最突出。

白腹鷺COⅠ基因序列共有722個(gè)位點(diǎn)(表2)。C含量最高，G含量最低。A+T(52.5%)高于G+C(47.5%)。嘧啶含量(57.0%)高于嘌呤含量(43.0%)。第一位點(diǎn)的A+T(41.5%)低于G+C(58.5%)，第二位點(diǎn)和第三位點(diǎn)的A+T均高于G+C。第一位點(diǎn)上堿基含量比較平均；第二位點(diǎn)上T高達(dá)41.0%，A只有14.9%；第三位點(diǎn)上A含量最高，G最少，堿基偏倚現(xiàn)象在第三位點(diǎn)最明顯。

2.2 鷺屬基因序列特征及種間遺傳距離

本研究獲得白腹鷺的Cytb基因片段，合并來自NCBI的另外5種鷺屬鳥類的同源區(qū)序列(NCBI中未查詢到黑冠白頸鷺A.cocoi的Cytb基因信息)。經(jīng)過比對(duì)排列后共有822個(gè)位點(diǎn)。除了中白鷺A+T的含量(49.3%)低于G+C的含量(50.7%)外，其余5種的A+T的含量均高于G+C的含量(表3)。保守位點(diǎn)650個(gè)，可變位點(diǎn)172個(gè)，簡約信息位點(diǎn)47個(gè)，單變異位點(diǎn)125個(gè)。物種間序列位點(diǎn)變異表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換多于顛換，R(轉(zhuǎn)換/顛換)的平均值為3.46。

表2 白腹鷺Cyt b和CO Ⅰ基因序列的各位點(diǎn)堿基組成Table 2 Sequence composition of Cyt b and CO Ⅰ genes of Ardea insignis

本研究獲得白腹鷺的COⅠ基因片段，合并來自NCBI的另外6種鷺屬鳥類的同源區(qū)序列，經(jīng)過比對(duì)排列后共有599個(gè)位點(diǎn)。A+T的含量均高于G+C的含量(表3)。保守位點(diǎn)485個(gè)，可變位點(diǎn)111個(gè)，簡約信息位點(diǎn)60個(gè)，單變異位點(diǎn)51個(gè)。物種間序列位點(diǎn)變異表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換多于顛換，R(轉(zhuǎn)換/顛換)的平均值為10.04。

基于COⅠ基因計(jì)算鷺屬各物種間的遺傳距離，白腹鷺與草鷺A.purpurea的遺傳距離最小(0.062)，與大白鷺的遺傳距離最大(0.093)(表4)。

表3 鷺屬7種的Cyt b和CO Ⅰ基因序列組成Table 3 Base composition of Cyt b andCO Ⅰ genes in the 7 Ardea species

表4 鷺屬7種的種間遺傳距離Table 4 Genetic distance between the 7 Ardea species

2.3 鷺屬系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于COⅠ和Cytb基因片段構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖1)，鷺屬鳥類構(gòu)成單系(支持率96%)。鷺屬7種鳥類中，最先分化的是大白鷺，其次是白腹鷺、草鷺。蒼鷺A.cinerea、大藍(lán)鷺A.herodias、中白鷺、黑冠白頸鷺聚為一支(支持率97%)。白腹鷺位于鷺屬分支內(nèi)，單獨(dú)聚為一支，無姐妹類群。

3 討論

3.1 白腹鷺的線粒體基因序列特征

線粒體基因序列的堿基組成研究較多，對(duì)74種鳥類線粒體基因組序列的分析表明，密碼子第二位的G、C含量波動(dòng)較小，第三位的波動(dòng)幅度大，這與第三位的C、T含量變化有關(guān)(高英凱等，2009)。白腹鷺Cytb和COⅠ基因序列的嘧啶和嘌呤含量有明顯差異，同樣是由第三位點(diǎn)上G、C含量變化引起，這與第三位點(diǎn)的變異通常不改變氨基酸編碼、受選擇壓力小有關(guān)(鐘東等，2002)。

在鳥類線粒體基因序列中，堿基組成存在一定的偏向性是普遍存在的現(xiàn)象(Arnaiz-Villenaetal. ，2001；Webb & Moore，2005)。偏倚情況可能因物種不同而不同，對(duì)24種雀類的研究表明，Cytb基因序列密碼子第一位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率相似，第二位點(diǎn)G的頻率明顯低于其他3種堿基，第三位點(diǎn)偏倚G、T(Arnaiz-Villenaetal. ，2001)。在本研究中，Cytb基因序列的第一、二位點(diǎn)均無明顯偏倚，但第三位點(diǎn)明顯偏倚G，在該位點(diǎn)上的堿基偏倚與上述雀類研究相似。白腹鷺COⅠ基因序列的堿基偏倚和Cytb基因不同，第一位點(diǎn)沒有明顯的偏倚，第二位點(diǎn)偏倚T，第三位點(diǎn)偏倚A。

3.2 白腹鷺的系統(tǒng)分類地位

根據(jù)本文結(jié)果，鷺屬7種聚為一支，該節(jié)點(diǎn)有較高的支持率(96%)，支持IOC分類系統(tǒng)中把白腹鷺、大白鷺、中白鷺均放入鷺屬中的處理(Gill &Donsker，2014)，這與目前國內(nèi)最新的鳥類分類系統(tǒng)相同(鄭光美，2017)。在鷺屬中，白腹鷺是較早分化的物種，遺傳距離分析表明和白腹鷺親緣關(guān)系最近的是草鷺。然而，Rasmussen和Anderton(2005)提及大嘴鷺Ardeasumatrana外部形態(tài)特征和白腹鷺最為接近，但大嘴鷺的物種地位尚不明確，抑或是白腹鷺的某些地理種群產(chǎn)生了形態(tài)分化，因此，白腹鷺的系統(tǒng)分類地位還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

圖1 基于Cytb+COⅠ基因序列構(gòu)建的鷺科14種鳥類的貝葉斯樹
Fig.1 Bayes tree of 14 species from family Ardeidae based onCytbandCOⅠ genes

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