牛麗紅， 周亮， 楊帆， 吳愛明， 付國強， 候琳琳， 李霄， 竇科峰， 陳輝， 張新尚*

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，成都610212； 2.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，西安710032)

藏酋猴Macacathibetana又名四川短尾猴、藏猴，隸屬于靈長目Primates猴科Cercopithecidae獼猴屬Macaca，是我國特有的非人靈長類物種，主要分布于中亞熱帶-北亞熱帶的四川、貴州、安徽、福建和浙江等地(蔣學(xué)龍等，1996)。藏酋猴為國家Ⅱ級重點保護(hù)野生動物，被《瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約(CITES)》列入附錄Ⅱ。

藏酋猴在組織結(jié)構(gòu)、生理代謝及遺傳等方面與人類接近，是理想的非人靈長類實驗動物，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中(王紅星等，2009；楊峰等，2010)。藏酋猴體型較大，接近甚至超過異種器官移植中常用的東非狒狒Papioanubis，其器官形態(tài)、大小與小型豬Susscrofa相似，且免疫系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)等與人類近似，已被成功應(yīng)用于異種器官移植研究中(陶開山等，2017)。藏酋猴性情溫順，易馴化，可在清醒狀態(tài)下進(jìn)行眼壓測定，其眼壓晝夜節(jié)律波動及對藥物(蘇為坦、唆嗎洛爾)的眼壓反應(yīng)與其他靈長類相似，表明藏酋猴是一種非常理想的眼睛疾病模型(Yietal. ，2012)。

為保護(hù)我國野生藏酋猴資源，分別于2004年和2016年從四川省馬邊彝族自治縣和金陽縣引入野生藏酋猴進(jìn)行人工馴養(yǎng)繁殖。由于人工定向養(yǎng)殖會增加動物近交程度而在不同程度上造成遺傳多樣性的降低，同時有可能因為人工選擇的作用而發(fā)生遺傳分化(Notter，1999)，因此，在實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化研究中，遺傳學(xué)控制十分重要。圈養(yǎng)條件下，應(yīng)避免因近親繁殖導(dǎo)致的種群遺傳多樣性降低，遺傳多樣性降低會使物種環(huán)境適應(yīng)能力和抗病性下降，對圈養(yǎng)藏酋猴種群生存產(chǎn)生威脅。相較于野生種群的隨機交配，藏酋猴在人工繁殖時通常采用一雄配多雌的策略，但目前還沒有對圈養(yǎng)種群子代的遺傳背景及遺傳多樣性信息進(jìn)行系統(tǒng)評估的研究，在一定程度上制約著藏酋猴封閉種群的建立和更廣泛的應(yīng)用。線粒體DNA控制區(qū)(mtDNA D-loop)作為mtDNA上最重要的非編碼區(qū)，富含A、T，堿基替換率比mtDNA其他區(qū)域高5～10倍，是研究親緣關(guān)系較近群體遺傳分化的理想分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于不同動物類群的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化研究(Zhuetal. ，1994；謝振宇等，2006；黃雪貞等，2012)。本研究利用mtDNA D-loop全長序列對自然交配與人工選擇2種不同繁殖模式下的子一代進(jìn)行遺傳多樣性評估，為制定科學(xué)有效的繁殖計劃，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化遺傳控制，增加圈養(yǎng)藏酋猴的遺傳多樣性和擴大種群數(shù)量提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

共選用102只藏酋猴個體，所有親本及金陽地區(qū)子一代均為野外捕捉個體，包括27只金陽地區(qū)親本個體(10歲以上)、27只金陽地區(qū)野生子一代(5歲以下)、24只馬邊地區(qū)親本個體和24只馬邊地區(qū)親本個體圈養(yǎng)繁殖子一代。采用EDTA抗凝管采集藏酋猴小隱靜脈血2 mL，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA的制備藏酋猴血液基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測基因組DNA的純度和濃度，合格樣本作為PCR擴增的模板。

1.2.2mtDNAD-loop序列引物設(shè)計、合成根據(jù)藏酋猴mtDNA序列信息(GenBank登錄號：EU294187)，在D-loop上下游保守區(qū)Cytb基因和12S rRNA區(qū)域設(shè)計特異性引物，引物序列為：F：5’-CACTAGTCTCCCTAATCGAAAACAACCTACTC-3’，R：5’-GTGCGTGCTTGATGCTTGCTCCTCTTG-3’；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3PCR擴增及測序PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括50 ng基因組DNA，2×Premix LA Taq聚合酶25 μL，上下游引物各2.5 μL(10 μM)，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小及純度。將確定為目的片段的PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行正、反向測序，測序引物與PCR擴增引物一致。

1.2.4數(shù)據(jù)分析利用Vector NTI對正、反向序列進(jìn)行重疊區(qū)拼接，除去多余的堿基片段，得到D-loop全長序列。通過BLAST與GenBank中藏酋猴mtDNA序列進(jìn)行比對，確認(rèn)PCR擴增得到的序列是藏酋猴mtDNA D-loop序列。用DnaSP 5統(tǒng)計多態(tài)位點數(shù)(S)、單倍型數(shù)(H)、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸變異數(shù)(K)等參數(shù)。采用Arlequin 2.0計算群體遺傳分化指數(shù)(FST)。用Kimura 2-parameter(K2P)模型計算遺傳距離，并使用MEGA6構(gòu)建鄰接(NJ)樹。

2 結(jié)果

2.1 藏酋猴mtDNA D-loop序列的堿基組成

通過對測序結(jié)果分析，去掉Cytb和12S rRNA區(qū)域序列，最終獲得了D-loop全長序列1 091 bp，其中，T、C、A、G的平均含量分別為25.8%、31.4%、30.2%、12.6%，A+T和C+G的平均含量分別為56.0%和44.0%(表1)。

表1 不同群體藏酋猴mtDNA D-loop全長序列的堿基組成Table 1 Base composition of mtDNA D-loop indifferent groups of Macacca thibetana

2.2 藏酋猴不同群體及子代的遺傳結(jié)構(gòu)

102個序列共檢測出115個變異位點，其中，轉(zhuǎn)換96次、顛換19次，轉(zhuǎn)換/顛換為5.1，插入或缺失位點2個(表2)。

表2 不同群體藏酋猴mtDNA D-loop序列變異情況Table 2 Variation of mtDNA D-loop in different groupsof Macacca thibetana

102只個體共檢測出66個單倍型，其中，金陽種群親本20個，子一代16個，二者共享1個單倍型；馬邊種群親本18個，子一代15個，二者共享 2個單倍型；馬邊種群與金陽種群無共享單倍型。2個種群親本及其子一代的Hd為0.812～0.975(表3)。在不同世代之間，金陽子一代的Pi略低于親本，而馬邊子一代的Pi略高于親本，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均處于較低水平。而對于藏酋猴不同地理種群而言，馬邊地區(qū)的Pi高于金陽地區(qū)。

表3 不同群體藏酋猴的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of D-loop indifferent groups of Macacca thibetana

藏酋猴2個種群親本及其子一代D-loop序列的遺傳距離見表4，金陽子一代與親本之間的遺傳距離為0.002 55，馬邊子一代與親本之間的遺傳距離為0.024 09，均未見明顯的遺傳分化。而馬邊地區(qū)和金陽地區(qū)之間的遺傳距離均大于0.05，說明2個地區(qū)的藏酋猴群體發(fā)生了中度遺傳分化。

表4 藏酋猴2個種群間的遺傳分化指數(shù)Table 4 Genetic differentiation between thetwo Macacca thibetana populations

2.3 藏酋猴種群的系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)雙參數(shù)法，結(jié)點的置信水平為1 000，計算了102只個體的遺傳距離，基于該距離建立了藏酋猴2個地理種群親本及其子一代的NJ樹(圖1)，金陽子一代(001～027)與親本(028～054)之間或馬邊子一代(055～078)與親本(079～102)之間均未形成明顯的分支，在進(jìn)化樹上互相交叉；而金陽地區(qū)(001～054)和馬邊地區(qū)(055～102)的個體出現(xiàn)了明顯的分支。

3 討論

藏酋猴在我國的地理分布范圍比較廣，僅次于獼猴Macacamulatta，但隨著近現(xiàn)代人為活動的加劇，生境碎片化導(dǎo)致藏酋猴種群數(shù)量下降(李生強等，2017)。為保護(hù)我國野生藏酋猴資源，開始圈養(yǎng)藏酋猴。但圈養(yǎng)種群人為設(shè)定藏酋猴的繁殖單元(一雄配多雌)，如果不通過遺傳控制管理，容易造成近親繁殖，影響種群的遺傳多樣性水平。

圖1 基于mtDNA D-loop序列構(gòu)建的藏酋猴群體間的鄰接樹Fig. 1 Neighbor-Joining tree based on the mtDNA D-loop sequences of Macacca thibetana

001～027. 金陽子一代， 028～054. 金陽親本， 055～078. 馬邊子一代， 079～102. 馬邊親本

001-027. F1of Jinyang population， 028-054. parents in Jinyang population， 055-078. F1of Mabian population， 079-102. parents in Mabian population

3.1 藏酋猴不同地理種群的遺傳多樣性

本研究基于mtDNA D-loop全長序列，選取S、H、Hd、Pi和K等參數(shù)研究了馬邊、金陽2個地理種群親本及其子一代的遺傳多樣性。Hd和Pi是mtDNA中用來衡量種群遺傳變異及遺傳多樣性的重要指標(biāo)，由于Pi考慮了各單倍型在群體中所占的比例，因而較Hd可靠(Zhouetal. ，2006)。分析結(jié)果表明，金陽和馬邊地區(qū)藏酋猴種群均處于單倍型多態(tài)性較高而核苷酸多態(tài)性較低的水平，這與貴州和云南地區(qū)藏酋猴種群遺傳多樣性的分析結(jié)果一致(Zhongetal. ，2013)，推測藏酋猴種群可能正從更小的有效種群經(jīng)歷種群擴張，所以它們擁有足夠的時間通過突變來積累單倍型多態(tài)性，但卻不足以增加核苷酸多態(tài)性。

3.2 野生與圈養(yǎng)條件下子一代的遺傳多樣性比較

目前，關(guān)于藏酋猴遺傳多樣性的報道還十分有限。Li等(2008)利用mtDNA D-loop的部分序列(476 bp)對四川和安徽黃山的藏酋猴進(jìn)行了遺傳多樣性分析，認(rèn)為這2個種群出現(xiàn)了明顯遺傳分化，是2個獨立的種群，并指出是由地理隔離導(dǎo)致的。姚永芳等(2013)利用mtDNA D-loop的部分序列(505 bp)對四川地區(qū)(峨眉、馬邊)和安徽黃山藏酋猴種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，表明不同地區(qū)的藏酋猴種群均存在不同程度的遺傳分化，且種群間基因交流貧乏。同樣的現(xiàn)象在云南地區(qū)和貴州地區(qū)的藏酋猴種群中也有發(fā)現(xiàn)(Zhongetal. ，2013)。由于野外采樣的不確定性，目前還沒有對同一種群來源的不同世代間的藏酋猴群體遺傳多樣性分析研究的報道。本研究首次分析了藏酋猴不同世代之間的群體遺傳變異情況，同時采用mtDNA D-loop全長序列對藏酋猴不同群體進(jìn)行分析，使結(jié)果更為可靠。金陽地區(qū)藏酋猴子一代為野生繁殖后代，而馬邊地區(qū)子一代為圈養(yǎng)條件下人工繁殖后代，通過這2個群體與親本群體的比較分析，有利于對比自然條件下和人工繁殖條件下子代群體遺傳多樣性的變化。相較于自然條件下的隨機交配，藏酋猴在人工繁殖的過程中多采用一雄配多雌的策略，且有多個繁殖單元，在遺傳背景信息不全的情況下，可能出現(xiàn)近交機率增加，有效種群數(shù)目減少，導(dǎo)致遺傳多樣性降低，遺傳效應(yīng)減弱，造成遺傳瓶頸。本研究發(fā)現(xiàn)，金陽地區(qū)藏酋猴子一代Pi與親本間并無顯著變化，馬邊地區(qū)子一代Pi也無顯著降低，金陽或馬邊地區(qū)不同世代的藏酋猴個體在NJ樹上互相交叉，各世代未形成獨有的進(jìn)化支，說明無論是自然繁殖還是人工繁殖，藏酋猴的子一代依然能夠保持與親本相當(dāng)?shù)倪z傳多樣性水平。雖然在目前繁殖方式下，藏酋猴子代的遺傳多樣性得到了保存，但藏酋猴整體的核苷酸多樣性還較低，在以后的繁育過程中，可利用更多的分子標(biāo)記對藏酋猴進(jìn)行遺傳多樣性及家系的遺傳管理，進(jìn)一步提高種群的遺傳多樣性水平。

本研究利用藏酋猴mtDNA D-loop全長序列分析了野外繁殖的親本與子一代、人工繁殖的親本與子一代以及子一代間的遺傳差異，建立了藏酋猴實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化遺傳控制體系，為科學(xué)有效地制定繁殖計劃、增加圈養(yǎng)藏酋猴種群的遺傳多樣性和擴大種群數(shù)量提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

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