張 露，黃祥霞，涂宗財(cái),,*，趙 伊，王 輝，王 豪，沙小梅，張恕雅

糖尿病是以持續(xù)高血糖為診斷特征的慢性代謝性疾病，血液中的高血糖水平容易引起葡萄糖自氧化和蛋白糖基化，從而導(dǎo)致自由基的過(guò)度形成[1]，增加機(jī)體中的氧化應(yīng)激壓力，降低抗氧化防御機(jī)制，最終促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[2]。研究表明，抑制α-葡萄糖苷酶的活性以降低餐后和空腹血糖水平是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效方法之一[3]，而清除機(jī)體中過(guò)度產(chǎn)生的活性氧自由基可在一定程度上緩解糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[2]。

蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）為睡蓮科多年生水生草本植物，廣泛分布于中國(guó)、印度、韓國(guó)、泰國(guó)和日本等地。在我國(guó)，蓮不僅是一種觀賞植物和受歡迎的食物，也是一種重要的可用于治療各種疾病的傳統(tǒng)中藥，其蓮花、蓮葉、蓮藕、蓮子和蓮心均可入藥，用于治療如腹瀉、嘔血、咳嗽、發(fā)熱、心律不齊和炎癥等各種疾病[4]。我國(guó)是蓮子生產(chǎn)大國(guó)，每年8～10月均有大量的蓮蓬殼、蓮殼和蓮衣等副產(chǎn)物被當(dāng)作廢棄物丟棄，這不僅污染了環(huán)境，還造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。Qi Suijian等[4]研究發(fā)現(xiàn)，蓮殼提取物可作為一種潛在的具有抗氧化和抗肥胖功能的天然食品添加劑。Kredy等[5]的研究表明蓮殼具有很好的抗氧化活性，且黃酮醇類為其主要活性成分。藥理研究表明蓮蓬殼具有較強(qiáng)的抗氧化作用[6]，可有效地抑制黑色素瘤細(xì)胞B16的增殖[7]，能夠改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[8]。陳軒[9]和李綺麗[10]等對(duì)蓮衣的活性成分和生物活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)蓮衣中含有多酚和黃酮類化合物，具有抗氧化活性。目前鮮有文獻(xiàn)比較研究蓮葉、蓮蓬殼、蓮殼、蓮衣和蓮心中的植物化學(xué)成分及其提取物的抗氧化和降血糖潛力。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較蓮葉、蓮蓬殼、蓮殼、蓮衣和蓮心中多酚、黃酮、三萜和縮合單寧的含量及其提取物的1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）自由基清除能力、2,2’-聯(lián)氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除能力、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力來(lái)研究蓮生產(chǎn)主要副產(chǎn)物的抗氧化和降血糖活性及其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮葉和蓮蓬于2016年9月采集于江西省贛州市石城鎮(zhèn)的蓮子種植基地，采集后樣品用自來(lái)水沖洗干凈，將蓮蓬分為蓮心、蓮蓬殼、蓮殼和蓮衣，將所有原料冷凍干燥后粉碎，于4 ℃貯存。

ABTS、DPPH、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 美國(guó)Sigma公司；沒食子酸（gallic acid，GAE）、槲皮素（quercetin，QuE）和所有其他試劑 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3200紫外-可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；KQ5200DE臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器 北京儀諾科興科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司。

1.3 方法

1.3.1 活性成分提取

采用超聲波輔助提取法提取蓮心、蓮蓬殼、蓮殼、蓮葉和蓮衣中的活性成分。準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末與30 mL 90%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇混合，500 W、50 ℃超聲處理30 min后，4 000 r/min離心8 min，收集上清液，殘?jiān)僭谙嗤瑮l件下提取兩次。最后合并所有上清液，減壓濃縮后用90%甲醇定容至50 mL。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

在地基的施工過(guò)程中，地下水問(wèn)題是常見的問(wèn)題之一。如果對(duì)地下水的處理方式不當(dāng)，不僅會(huì)影響地基的質(zhì)量，還會(huì)影響民用建筑的安全。在地基或樁基礎(chǔ)的施工過(guò)程中，若地下水位較高，應(yīng)采用合適的排水或止水方法。例如，可采用多樁抽水的方式降低地下水位。而地下水位較低時(shí)，可采用單樁抽水的方式，以降低地下水的水位。

采用AlCl3顯色法[11]測(cè)樣品中的總黃酮含量，取100 μL稀釋到適宜質(zhì)量濃度的樣品溶液，與100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% AlCl3·6H2O于96 孔板上混合，室溫反應(yīng)15 min后測(cè)其在430 nm波長(zhǎng)處的吸光度Ai。用甲醇代替質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% AlCl3·6H2O測(cè)得的吸光度為Aj，樣品溶液的吸光度ΔA＝Ai-Aj。以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的含量，結(jié)果用每克干物質(zhì)中槲皮素當(dāng)量表示（mg QuE/g）。重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定總酚含量[12]。取0.2 mL 20 倍稀釋的樣品與0.1 mL福林-酚試劑混勻，室溫反應(yīng)5 min后，加入0.3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Na2CO3和1.0 mL水，避光反應(yīng)30 min后取200 μL于96 孔板上，測(cè)其在765 nm波長(zhǎng)處的吸光度，用水代替福林-酚作空白，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總酚含量，結(jié)果用每克干物質(zhì)中沒食子酸當(dāng)量表示（mg GAE/g）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.4 總?cè)坪康臏y(cè)定

根據(jù)Uysal等[13]的方法測(cè)定樣品中總?cè)频暮?。?00 μL稀釋后的樣品與0.5 mL 5 g/mL香草醛-冰醋酸和1.0 mL高氯酸混合，60 ℃反應(yīng)20 min后冰水冷卻10 min，加入3.0 mL冰醋酸，室溫反應(yīng)10 min后用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品在547 nm波長(zhǎng)處的吸光度，用不含香草醛-冰醋酸的溶液為空白。以齊墩果酸（oleanolic acid，OAE）為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總?cè)坪?，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)中齊墩果酸當(dāng)量（mg OAE/g）。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.5 總縮合單寧含量的測(cè)定

采用香草醛方法測(cè)總縮合單寧的含量[14]。取100 μL稀釋到適宜質(zhì)量濃度的樣品與0.7 mL新鮮配制的1%香草醛溶液（用7 mol/L濃硫酸配制）混勻，以7 mol/L濃硫酸代替香草醛溶液的反應(yīng)體系為空白，避光反應(yīng)15 min后取200 μL于96 孔板上，測(cè)其在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以兒茶素（catechin，CaE）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總縮合單寧含量，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)中兒茶素當(dāng)量（mg CaE/g）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

參照按照Z(yǔ)hang Lu等[11]的方法，采用DPPH自由基和ABTS+·兩種模型比較蓮葉、蓮蓬殼、蓮殼、蓮衣和蓮心提取物的自由基清除能力。以槲皮素為對(duì)照品，采用Origin 8軟件中的多項(xiàng)擬合計(jì)算樣品清除50%的自由基所需要的樣品質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.7 FRAP分析

參照Drogoudi等[15]的方法評(píng)價(jià)樣品的FRAP。取10 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與250 μL新鮮制備的FRAP溶液（用0.3 mol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液配制的含有10 mmol/L三吡啶基三嗪和40 mmol/L FeCl3的混合液）混合。37 ℃反應(yīng)10 min后采用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在593 nm波長(zhǎng)處的OD值。以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，OD值越高，表示樣品的還原能力越強(qiáng)。OD0.3表示使反應(yīng)體系的OD值為0.3時(shí)所需要的樣品質(zhì)量濃度。

1.3.8 α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

按照Z(yǔ)hang Lu等[11]的方法研究樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)Origin 8.0軟件中的多項(xiàng)擬合計(jì)算樣品的IC50。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用皮爾森相關(guān)性分析活性成分含量與抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用間的相關(guān)性。以P＜0.05表示差異或相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚、總黃酮、總?cè)坪涂偪s合單寧含量分析

表1 5 種樣品中的主要化學(xué)成分Table 1 Contents of total phenols, total flavonoids, total triterpenoids and total condensed tannins in extracts from five samples

酚類、黃酮類、三萜和縮合單寧是植物中4 種主要的化學(xué)成分，因此本研究比較了其在蓮葉、蓮蓬殼、蓮殼、蓮衣、蓮心5 種提取液中的含量，結(jié)果如表1所示。5 種不同提取溶液中總酚、總黃酮、總?cè)啤⒖偪s合單寧的含量范圍分別是44.35～232.50 mg GAE/g、4.84～41.48 mg QuE/g、72.34～423.75 mg OAE/g和1.42～36.13 mg CaE/g。由表1可知，蓮蓬殼提取物具有最大的總酚（232.50 mg GAE/g）和總?cè)坪浚?23.75 mg OAE/g），蓮心中的總酚（44.35 mg GAE/g）和總?cè)坪浚?2.34 mg OAE/g）最低，分別僅約為蓮蓬殼的1/5和1/6。但蓮葉、蓮殼和蓮衣中三萜類化合物的含量相近，且無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本研究中的總酚含量變化趨勢(shì)與Wu Yanbin等[16]的報(bào)道相似，其研究表明蓮蓬殼中的總酚含量高于蓮殼、蓮葉和蓮心。蓮葉提取物中的總黃酮含量最高，達(dá)41.48 mg QuE/g，而蓮蓬殼和蓮心提取物、蓮殼和蓮衣提取物中的總黃酮含量無(wú)顯著的差異（P＞0.05）。蓮衣提取物具有最高的總縮合單寧含量（36.13 mg CaE/g），而蓮葉和蓮蓬殼次之（P＞0.05）。Chen Sha等[17]的研究表明蓮心提取物中的黃酮含量（7.30 mg QuE/g）高于蓮葉、蓮蓬殼和蓮殼，但其值遠(yuǎn)小于本研究所檢測(cè)到的黃酮含量。這可能是由于原料的采集時(shí)間、地理位置、樣品的提取方法和原料的干燥方法的不同所引起[18-19]。馮娟等[20]比較了12 個(gè)產(chǎn)地的蘋果中總酚含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地蘋果中的總酚含量在101.99～177.62 mg/100 g之間。楊鵬等[21]研究了不同產(chǎn)地和不同采集時(shí)間對(duì)蓮葉中蘆丁含量的影響，發(fā)現(xiàn)來(lái)自

湖南、山東等16 個(gè)不同產(chǎn)地的蓮葉樣品中的蘆丁含量在1.31～4.08 μg/g之間，而于7～11月5 個(gè)不同時(shí)間采集的蓮葉樣品中的蘆丁含量為0.71～1.55 μg/g。

2.2 DPPH自由基清除能力分析

圖1 5 種樣品提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 1 DPPH free radical scavenging activity of five extracts

表2 5 種樣品提取物的抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Table 2 Antioxidant activity and α-glucosidase inhibition of five extracts μg/mL

表3 5 種樣品中化學(xué)成分與其抗氧化能力、α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients between chemical constituents and antioxidant abilities and α-glucosidase inhibition of five samples

蓮葉、蓮蓬殼、蓮殼、蓮衣和蓮心的DPPH自由基清除能力如圖1所示，其IC50如表2所示。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度從31.25 μg/mL增加至250 μg/mL時(shí)，所有樣品的DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，且當(dāng)清除能力低于75%時(shí)，樣品的DPPH自由基清除能力表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。蓮蓬殼提取物具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，其IC50為54.81 μg/mL，其次是蓮衣提取物（IC50為88.96 μg/mL），且蓮蓬殼和蓮衣提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力高于陽(yáng)性對(duì)照組槲皮素（IC50為144.48 μg/mL）。蓮心提取物的IC50（643.90 μg/mL）最高，說(shuō)明蓮心清除DPPH自由基的能力最低，這可能是由于蓮心提取物中總酚、總?cè)坪涂偪s合單寧的含量最低所引起。相關(guān)性分析顯示，DPPH自由基清除能力與樣品中總酚、總?cè)坪涂偪s合單寧含量有很高的相關(guān)性，而與黃酮含量幾乎無(wú)相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.803、0.692、0.700和0.039（表3）。

2.3 ABTS+·清除能力分析

圖2 5 種樣品提取物的ABTS＋ ·清除能力Fig. 2 ABTS＋· scavenging ability of five extracts

樣品的ABTS+·清除能力結(jié)果如圖2和表2所示，其變化趨勢(shì)與DPPH自由基清除能力的變化趨勢(shì)相同，兩者之間的相關(guān)系數(shù)為0.978（表3），顯示良好的正相關(guān)關(guān)系，這可能是由于這兩種模型的機(jī)制都是評(píng)價(jià)樣品提供氫原子的能力[22]。5 種提取物的ABTS+·清除能力的IC50由小到大為：蓮蓬殼＜蓮衣＜蓮殼＜蓮葉＜蓮心。蓮蓬殼提取物具有最低的IC50（27.84 μg/mL），因此具有最強(qiáng)的ABTS+·清除能力，分別為蓮葉和蓮心的4.5 倍和14.4 倍，且高于槲皮素（IC50為32.66 μg/mL）。Zheng Lijun等[23]的研究也表明蓮蓬殼提取物具有較高的抗氧化能力。相關(guān)性分析顯示，樣品中的總酚含量與其ABTS+·清除能力具有最大的相關(guān)系數(shù)（r＝0.776），其次是三萜類化合物（r＝0.687）和縮合單寧（r＝0.675）（表3）。所以，樣品中的酚類物質(zhì)對(duì)ABTS+·清除能力的貢獻(xiàn)最大，三萜類化合物和縮合單寧類化合物次之。許多研究也表明，酚類化合物為植物中清除ABTS+·的主要活性成分[24-25]。

2.4 FRAP分析

圖3 5 種樣品提取物的FRAPFig. 3 Ferric ion reducing power of five extracts

為驗(yàn)證DPPH自由基和ABTS+·模型測(cè)得的結(jié)果，采用FRAP實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)樣品的抗氧化活性。如圖3和表2所示，所有提取物均具有明顯的劑量依賴性。蓮蓬殼提取物具有最高的FRAP，其OD0.3值僅為61.32 μg/mL，其次是蓮衣提取物。蓮心提取物的FRAP最弱的，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL時(shí)，其FRAP隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，且OD0.3值超過(guò)1 mg/mL（圖中未顯示）。另外，樣品的FRAP與其清除DPPH自由基和ABTS+·的相關(guān)系數(shù)分別為0.835和0.871（表3），表明蓮子生產(chǎn)副產(chǎn)物的FRAP與DPPH自由基和ABTS+·清除能力有著良好的正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性分析也表明，F(xiàn)RAP與樣品中總酚含量的相關(guān)性最高，其次是三萜類和縮合單寧類化合物，相關(guān)系數(shù)分別為0.889、0.832和0.650。Wu Yanbin等[16]的研究也表示，與蓮衣、蓮葉、蓮心比較，蓮蓬殼具有較高的DPPH自由基和ABTS+·清除能力，酚類物質(zhì)為其主要活性成分。結(jié)合DPPH自由基和ABTS+·抗氧化模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1、2和表2）可以得出，蓮蓬殼是優(yōu)于蓮葉、蓮殼、蓮衣和蓮心的抗氧化劑資源。酚類、三萜類化合物和縮合單寧是蓮蓬殼中主要的抗氧化活性成分。Hu Weicheng等[26]也發(fā)現(xiàn)蓮蓬殼提取物具有較好的抗氧化活性。

2.5 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

圖4 5 種樣品提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用Fig. 4 α-Glucosidase inhibition of five extracts

如圖4所示，蓮葉、蓮蓬殼、蓮殼和蓮衣提取物均具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，其IC50的變化范圍為15.18～176.84 μg/mL，顯著高于糖尿病臨床治療藥物阿卡波糖（1.29 mg/mL）（P＜0.05）。蓮蓬殼具有最高的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，其IC50僅為15.18 μg/mL，其次是蓮殼、蓮衣，這3 種樣品抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力分別為阿卡波糖的85 倍、32.9 倍、21.7 倍。Huang Chunfa等[27]研究發(fā)現(xiàn)蓮葉及其活性成分兒茶素能有效控制II型糖尿病小鼠的血糖水平。然而，蓮心提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性起著促進(jìn)作用。Kato等[28]發(fā)現(xiàn)蓮心能促進(jìn)小鼠對(duì)葡萄糖的吸收，從而提高血液中血糖水平，且去甲烏藥堿4’-O-β-D-葡萄糖苷為其活性成分，這可能是蓮心促進(jìn)α-葡萄糖苷酶活性的原因。但為探明蓮心促進(jìn)α-葡萄糖苷酶活性的具體成分和作用機(jī)制，需要開展進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

針對(duì)當(dāng)前蓮子生產(chǎn)副產(chǎn)物利用率低、附加值不高的現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)比較研究了蓮心、蓮蓬殼、蓮殼、蓮葉和蓮衣5 種蓮子生產(chǎn)副產(chǎn)物中總酚、總黃酮、總縮合單寧和總?cè)坪考捌涮崛∥锏目寡趸钚院挺?葡萄糖苷酶活性抑制能力。結(jié)果表明，蓮蓬殼提取物有最高的總酚和總?cè)坪?；蓮葉提取物中的黃酮類化合物含量最多，而蓮衣具有最高的總縮合單寧含量?？寡趸钚苑治鲲@示，蓮蓬殼提取物的自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最強(qiáng)，且其抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力約為阿卡波糖的85 倍，酚類、三萜和縮合單寧為蓮葉副產(chǎn)物中的主要抗氧化成分。以上結(jié)果表明，蓮蓬殼可以作為一種潛在的天然抗氧化和降血糖資源，具有開發(fā)為預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的保健品的潛力。本研究對(duì)促進(jìn)蓮子副產(chǎn)物的深入研究和高值化利用具有重要參考價(jià)值。

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