李彬彬，張雅晴，趙利利，毛 順，盧士玲*

熏馬腸是新疆哈薩克民族特色的傳統(tǒng)肉類制品，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量極高、脂肪含量少但多不飽和脂肪酸所占比例高的發(fā)酵肉制品。熏馬腸作為優(yōu)質(zhì)獨(dú)特的功能性食品，具有很好的銷售前景，但由于其在加工成熟及貯藏過程中產(chǎn)生的生物胺累積，造成了一定的食品安全隱患[1]。

食物中存在生物胺的累積現(xiàn)象，主要可能由于十分充足的前體物質(zhì)的存在，還有許多含有氨基酸脫羧酶基因的細(xì)菌以及能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)并且對(duì)脫羧酶活性有促進(jìn)作用的環(huán)境因素造成[2]。在所有胺類化合物中，組胺和酪胺被確認(rèn)毒理作用最強(qiáng)。當(dāng)它們作用于機(jī)體時(shí)，會(huì)對(duì)人類的精神狀態(tài)、血管活性造成影響，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性反應(yīng)[3]。此外生物胺具有良好的熱穩(wěn)定性，食品加工和制備過程中的高溫對(duì)其破壞力有限，目前只能通過預(yù)防和監(jiān)測(cè)的方式來有效控制生物胺在食品加工中的形成從而延長(zhǎng)食品鏈[4]。

據(jù)目前大量研究結(jié)果來看，發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸中生物胺的產(chǎn)生具有良好的控制作用[5]，如乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌[6]。乳酸菌在原料肉中數(shù)量極低（3～4（lg（CFU/g））），但它能夠在很短時(shí)間內(nèi)提高乳酸菌的數(shù)量，使其在發(fā)酵初期成為熏馬腸中的優(yōu)勢(shì)菌株（8（lg（CFU/g））），葡萄球菌能夠在發(fā)酵過程中分解原料形成風(fēng)味化合物[7]。乳酸菌分解產(chǎn)生大量乳酸或有機(jī)酸導(dǎo)致pH值在短時(shí)間內(nèi)快速降低，抑制了腐敗微生物的生長(zhǎng)，從而減少生物胺的積累[8]。添加香辛料和天然植物提取物對(duì)原料肉進(jìn)行腌制[9]，也是目前控制生物胺產(chǎn)生的重要途徑，它能夠使熏馬腸中的初始微生物的數(shù)量和種類得到有效控制。

微生物宏基因組分類測(cè)序是根據(jù)對(duì)被檢樣品中微環(huán)境的基因序列實(shí)施檢測(cè)，能夠高效準(zhǔn)確地辨別其中微生態(tài)物種的類別以及相對(duì)豐度。宏基因組學(xué)目前已被廣泛應(yīng)用到發(fā)酵制品的發(fā)酵加工過程中，對(duì)微生物多樣性和動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究。新疆熏馬腸發(fā)酵成熟時(shí)期涉及多菌種共同作用，分化發(fā)酵肉中微生物種類以及在各時(shí)期的變化規(guī)律和機(jī)理，對(duì)于深入研究其發(fā)酵機(jī)理和構(gòu)建發(fā)酵時(shí)期的監(jiān)測(cè)手段和控制途徑具有舉足輕重的意義。本實(shí)驗(yàn)將利用宏基因組學(xué)的方法對(duì)熏馬腸發(fā)酵成熟時(shí)期的細(xì)菌群落的構(gòu)成和多樣性進(jìn)行詳細(xì)監(jiān)測(cè)，旨在為發(fā)酵劑和大蒜精油對(duì)熏馬腸發(fā)酵成熟過程中優(yōu)勢(shì)菌群的發(fā)掘和腐敗微生物的抑制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

屎腸球菌（Enterococcus faecium）KT923202、糞腸球菌（E. faecalis）KT923193均為本實(shí)驗(yàn)室從熏馬腸中分離篩選。

馬肉購(gòu)自石河子牧民家庭；輔料（天然動(dòng)物腸衣、食鹽、煙熏液）均為市售。

改良后的甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基（manitol salt agar，MSA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（violet red bile agar，VRBA）、MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物試劑公司；發(fā)酵劑 科漢森菌種有限公司；大蒜精油仲景大廚房股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

甲醇、乙腈（均為色譜純） 天津福晨化學(xué)試劑廠；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺、丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl））美國(guó)Sigma公司。

T25型勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；BagMixer 400VW型均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司；9020-0094 KBF 240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 新疆熏馬腸的制作

配方：瘦肉80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、肥肉20%、食鹽2.5%、白糖2%、亞硝酸鈉0.02%、胡椒粉0.1%、花椒粉0.15%、姜粉0.2%、味精0.1%、五香粉0.1%、八角0.1%、煙熏液1%、大蒜精油0.025%、發(fā)酵劑0.025%。

工藝流程：原料肉處理（紫外燈照射30 min）→修整、切丁（切小拇指上指尖大?。淞稀缰疲? ℃，1 d）→接種→灌腸→發(fā)酵（18 ℃，相對(duì)濕度90%～95%，2 d）→成熟（12 ℃，相對(duì)濕度70%～75%，25 d）→成品。

分別在第0、3、7、14、21、28天取樣，每次取一根，每根香腸分裝成5 節(jié)，對(duì)微生物數(shù)量、水分含量、pH值測(cè)定，置于-20 ℃冷凍保藏，以備生物胺的測(cè)定。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將1.3.1節(jié)處理好的原料肉均勻地分為8 組，其中4 組接種濃度約為103CFU/mL的屎腸球菌和糞腸球菌菌液作為產(chǎn)胺菌接種劑，另外4 組不接種產(chǎn)胺菌。然后在模擬發(fā)酵條件下進(jìn)行熏馬腸的發(fā)酵和成熟，并在發(fā)酵過程中的第0、3、7、14、21、28天分別取樣，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

對(duì)原料馬肉分別做如下處理：第1組（OJ）添加大蒜精油和接種產(chǎn)胺菌；第2組（CK）空白對(duì)照組；第3組（S）只添加發(fā)酵劑；第4組（SO）添加發(fā)酵劑和大蒜精油；第5組（O）只添加大蒜精油；第6組（SOJ）添加發(fā)酵劑和大蒜精油及接種產(chǎn)胺菌；第7組（SJ）添加發(fā)酵劑和接種產(chǎn)胺菌；第8組（J）接種產(chǎn)胺菌。每組腐敗菌的接種量均約為103CFU/g。發(fā)酵劑為清酒乳桿菌和肉糖葡萄球菌，添加量為106CFU/g。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù)

取10 g香腸，加入到90 mL無菌生理鹽水中，在室溫下200 r/min搖床培養(yǎng)30 min。然后根據(jù)微生物實(shí)驗(yàn)操作書上的要求進(jìn)行規(guī)范操作，吸取適當(dāng)濃度菌液于對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基進(jìn)行均勻涂布。乳酸菌用MRS培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)72 h；葡萄球菌/微球菌用MSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h；腸細(xì)菌用VRBA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.4 樣品pH值測(cè)定

無菌條件下取樣品20 g于180 mL滅菌生理鹽水，裝入無菌拍打袋中。使用拍打機(jī)，強(qiáng)度調(diào)至4拍打20 min，直至樣品完全散開在無菌生理鹽水中，上清液用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 樣品生物胺含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]的方法，取5 g熏馬腸樣品加入20 mL的0.4 mol/L的高氯酸，取上述樣品1 mL，加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液使溶液呈堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后再加入2 m L 10 mg/mL的DNS-Cl丙酮溶液，使之在黑暗條件40 ℃反應(yīng)，45 min后加入100 μL的NH3·H2O終止反應(yīng)，去除殘留的DNS-Cl溶液。用乙腈定容到5 mL，用0.22 μm濾膜過濾后裝入樣品瓶待測(cè)。

色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈；流速為0.9 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。梯度洗脫程序?yàn)椋?.1 min、35% A；5.0 min、25% A；44 min、0% A；55 min、35% A。1.3.6 宏基因組學(xué)測(cè)序

將8 組熏馬腸發(fā)酵成熟所有時(shí)期的共41 個(gè)樣品，無菌條件下取樣送至華大基因測(cè)序公司進(jìn)行宏基因組學(xué)測(cè)序。對(duì)樣品純度進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫：回收目的Amplicon片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再通過3’端加堿基“A”，使得DNA片段能與3’端帶有“T”堿基的特殊接頭連接。也可通過對(duì)具有測(cè)序接孔的雙Index融合引物進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成，以DNA為模板，對(duì)PCR引物進(jìn)行融合。磁珠篩選目的Amplicon片段，最后，用合格的文庫進(jìn)行cluster制備和測(cè)序。用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的生物信息分析。

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的Clean data方可用于后期分析。通過reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags。在規(guī)定的一定相似度下將Tags集聚合成操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），最后將OTU與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋?；贠TU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析以及組間物種差異分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)從液相分析平臺(tái)導(dǎo)出，用Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫，并用DPS 7.05版進(jìn)行鄧肯氏多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值分析

pH值的下降是熏馬腸在發(fā)酵成熟過程中的一個(gè)顯著變化，新鮮馬肉的初始pH值為5.78。由表1可知，8 組熏馬腸在發(fā)酵初期（0～3 d），pH值迅速下降，接種發(fā)酵劑組熏馬腸的酸化程度要顯著高于對(duì)照組的熏馬腸（P＜0.05），主要是由于發(fā)酵劑或接種的乳酸菌等微生物作用于內(nèi)源或添加的糖等碳水化合物，使其分解為乳酸、醋酸或其他有機(jī)酸，從而導(dǎo)致pH值降低，pH值降低可以有效抑制雜菌的生長(zhǎng)。因此，未接種的對(duì)照組pH值下降過程不明顯，發(fā)酵結(jié)束后pH值為5.3。發(fā)酵結(jié)束后pH值下降緩慢，這是由于成熟溫度為18 ℃，要低于發(fā)酵溫度，導(dǎo)致一些微生物生長(zhǎng)速率緩慢，產(chǎn)酸能力受到抑制。直到成熟期21 d，pH值開始回升，主要原因是在成熟過程中，水分蒸發(fā)流失，含氮化合物被乳酸菌利用作為能源，蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性緩沖物質(zhì)如生物胺的積累。在成熟結(jié)束后，各組樣品的pH值大多處于4.64～4.92之間，依然能夠?yàn)槭称诽峁┮粋€(gè)較低的酸性環(huán)境，能夠很好地抑制細(xì)菌的氨基酸脫羧酶活性，從而控制生物胺的產(chǎn)生。Fanco等[11]報(bào)道，pH 5左右的酸性條件有利于維持發(fā)酵香腸貨架期的穩(wěn)定性。但這一結(jié)果要低于Lu Shiling等[9]終產(chǎn)品中的pH值，可能是由于所使用的馬肉品質(zhì)間的差異所致。通過比較分析可得，添加發(fā)酵劑組pH值下降幅度顯著（P＜0.05）大于未接種發(fā)酵劑組，并且在終產(chǎn)品中的pH值顯著低于未接種發(fā)酵劑組（P＜0.05）；與接種發(fā)酵劑相比，添加大蒜精油對(duì)熏馬腸pH值的作用效果并不明顯（P＞0.05），這與Bozkurt[12]的研究結(jié)果較為相似。

表1 新疆熏馬腸在成熟過程中pH值變化情況Table 1 Change in pH during the ripening of smoked horsemeat sausages

2.2 微生物分布分析2.2.1 乳酸菌分析

表2 新疆熏馬腸在成熟過程中乳酸菌生長(zhǎng)情況（n＝6）Table 2 Growth of lactic acid bacteria during the ripening of smoked horsemeat sausages (n= 6)lg（CFU/g）

由表2可知，不同處理的樣品在發(fā)酵成熟過程中乳酸菌數(shù)量存在差異。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（0～3 d），除CK和O組，其他香腸中的乳酸菌都迅速由原料肉中的3.85（lg（CFU/g））增長(zhǎng)到7.36～8.38（lg（CFU/g）），通常情況下生鮮肉中的乳酸菌數(shù)量在3～4（lg（CFU/g））[13]，其中接種發(fā)酵劑組的熏馬腸，乳酸菌數(shù)量平均都在8.22（lg（CFU/g）），顯著高于其他未接種發(fā)酵劑的熏馬腸（P＜0.05）。此結(jié)果與Mokhtar等[5]研究結(jié)果相比，對(duì)照組乳酸菌數(shù)量高1.587（lg（CFU/g）），接種發(fā)酵劑組平均高1.159（lg（CFU/g）），這可能是由于原料肉品質(zhì)間的差異引起的，也可能是發(fā)酵劑中菌種活性不同所致。在熏馬腸的整個(gè)成熟階段，加入大蒜精油對(duì)接種產(chǎn)胺菌組的乳酸菌數(shù)量有一定抑制作用。在未接種發(fā)酵劑的樣品中，乳酸菌依然成為了優(yōu)勢(shì)菌，之前許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者已有報(bào)道[14]。在成熟結(jié)束后（第28天），每組熏馬腸中的乳酸菌數(shù)量在6.44～7.47（lg（CFU/g））之間，與國(guó)際上建議的乳酸菌在功能性食品中的數(shù)量范圍6～8（lg（CFU/g））相符[15]，說明產(chǎn)品具有一定的可信度。2.2.2 微球菌和葡萄球菌分析

表3 新疆熏馬腸在成熟過程中微球菌和葡萄球菌生長(zhǎng)情況（n＝6）Table 3 Growth of Micrococcus and Staphylococcus during the ripening of smoked horsemeat sausages (n= 6)lg（CFU/g）

由于微球菌和葡萄球菌具有解朊作用和分解脂肪活性，因此與乳酸菌一起作為發(fā)酵劑被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵香腸中。為研究發(fā)酵劑和大蒜精油對(duì)微球菌和葡萄球菌數(shù)量的影響，分別對(duì)8 組熏馬腸樣品中檢測(cè)出的微球菌和葡萄球菌數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及多重比較，結(jié)果見表3。接種發(fā)酵劑組的熏馬腸中微球菌和葡萄球菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他未接種發(fā)酵劑組（P＞0.05），數(shù)量在5.5（lg（CFU/g））左右，而未接種發(fā)酵劑的熏馬腸中微球菌和葡萄球菌數(shù)量在4.5（lg（CFU/g））左右，接種發(fā)酵劑組比未接種發(fā)酵劑組高1（lg（CFU/g））左右。該結(jié)果與Gücüko?lu等[16]研究接種不同發(fā)酵劑的發(fā)酵香腸在發(fā)酵結(jié)束后，微球菌和葡萄球菌數(shù)量在5.66～5.80（lg（CFU/g））相近。微球菌和葡萄球菌在發(fā)酵階段雖然數(shù)量增長(zhǎng)的幅度遠(yuǎn)低于乳酸菌，也可能是乳酸菌的快速產(chǎn)酸不利于其增殖，但接種發(fā)酵劑對(duì)微球菌和葡萄球菌的快速增殖還是有一定促進(jìn)作用。到熏馬腸成熟的第21天時(shí)，添加大蒜精油對(duì)添加發(fā)酵劑的熏馬腸中微球菌和葡萄球菌數(shù)量沒有顯著抑制作用。在熏馬腸終產(chǎn)品中，各組樣品中的微球菌和葡萄球菌數(shù)量在3.83～5.63（lg（CFU/g））之間，與一些學(xué)者報(bào)道的發(fā)酵香腸中微球菌數(shù)量相近（4.1～5.9（lg（CFU/g）））[17]。

2.2.3 腸細(xì)菌分析

表4 熏馬腸在成熟過程中腸細(xì)菌生長(zhǎng)情況（n＝6）Table 4 Growth of Enterobacteria during the ripening of smoked horsemeat sausages (n= 6)lg（CFU/g）

腸細(xì)菌比起乳酸菌、微球菌和葡萄球菌，可以說是一類不受歡迎的菌種，大量的腸細(xì)菌存在于發(fā)酵香腸時(shí)可同時(shí)產(chǎn)生尸胺和腐胺。其常在肉中出現(xiàn)，如果在不適宜的環(huán)境下加工肉制品，很可能導(dǎo)致致病性危害以及對(duì)發(fā)酵香腸的感官品質(zhì)造成影響[18]；同時(shí)它也能通過水解蛋白、分解脂肪和分解糖等作用為發(fā)酵香腸貢獻(xiàn)芳香化合物[19]。在熏馬腸成熟時(shí)期中取樣檢測(cè)腸細(xì)菌數(shù)量，從表4可以看出，各組在發(fā)酵結(jié)束后，腸細(xì)菌數(shù)量變化不大，添加大蒜精油組腸細(xì)菌數(shù)量顯著低于未添加大蒜精油組（P＜0.05）。到熏馬腸成熟第7天時(shí)，腸細(xì)菌的數(shù)量出現(xiàn)了兩種變化情況，添加大蒜精油和接種發(fā)酵劑組熏馬腸中的腸細(xì)菌數(shù)量顯著減少，且添加大蒜精油組比接種發(fā)酵劑組減少效果更顯著（P＜0.05），而其余各組熏馬腸中的腸細(xì)菌數(shù)量均有一定程度的增長(zhǎng)，說明大蒜精油對(duì)腸細(xì)菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制效果，而發(fā)酵劑在熏馬腸成熟階段對(duì)減少腸細(xì)菌數(shù)量上也做出一定的貢獻(xiàn)，這與Simion等[20]研究結(jié)果相符。成熟第28天時(shí)，各組熏馬腸樣品中的腸細(xì)菌數(shù)量都相對(duì)較低，說明使用的原料肉符合良好的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，添加發(fā)酵劑和精油對(duì)腸細(xì)菌有顯著的抑制作用，但接種發(fā)酵劑和添加大蒜精油處理組之間腸細(xì)菌數(shù)量沒有顯著性的差異（P＞0.05）。

2.3 微生物多樣性分析

通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類并在科分類等級(jí)對(duì)各個(gè)樣品作物種分布柱狀圖。圖1為41 個(gè)熏馬腸樣品在科水平中物種相對(duì)豐度柱狀圖，不同色塊寬度表示不同物種相對(duì)豐度比例。如圖1所示，在科水平上除SJ-21其他所有樣品乳桿菌科（Lactobacillaceae）相對(duì)豐度占細(xì)菌類群的50%以上，其中S-3、OJ-7、O-14、SO-14的相對(duì)豐度高達(dá)90%，說明乳酸菌的確在熏馬腸整個(gè)發(fā)酵成熟過程中是優(yōu)勢(shì)菌群。而假單胞菌科（Pseudomonadales）在SJ-21樣品中占主導(dǎo)地位相對(duì)豐度約為60%，其次在SOJ-7中也出現(xiàn)一定比例，說明這兩組樣品在加工成熟過程中有可能受到污染，但在成熟結(jié)束時(shí)，在所有熏馬腸樣品中都沒有發(fā)現(xiàn)假單胞菌的存在，可能是水分缺失，不利于其生長(zhǎng)。由表5中可以看出，SOJ-7與同一時(shí)期其他樣品相比，酪胺含量較高，達(dá)到82.40 mg/kg，而SJ-21組產(chǎn)生的尸胺和酪胺的含量均顯著高于其他組，Li Miaoyun等[21]也證實(shí)了假單胞菌通常是腐胺、酪胺和組胺的產(chǎn)生菌，這與本實(shí)驗(yàn)所研究結(jié)論相符。除此之外，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）在J-3、SJ-14、O-21、S-21、SO-21、OJ-28和SO-28這7 個(gè)樣品中相對(duì)豐度相對(duì)較高，約為10%～20%，由此可以看出，葡萄球菌常出現(xiàn)在發(fā)酵肉制品的成熟后期，是為發(fā)酵香腸的風(fēng)味貢獻(xiàn)產(chǎn)香物質(zhì)的主要菌群。Essid等[7]研究表明，葡萄球菌在發(fā)酵香腸中有兩大貢獻(xiàn)，一是酸化作用，二是反硝化作用，如脂解作用和蛋白質(zhì)水解作用，同時(shí)還能生成低分子質(zhì)量化合物如肽類、氨基酸等賦予發(fā)酵肉香氣成分。

圖1 樣品科分類水平中物種相對(duì)豐度柱狀圖Fig. 1 Relative abundance of sequences assigned to families

2.4 生物胺含量分析

如表5所示，每種樣品中各種生物胺數(shù)據(jù)的變化可能要結(jié)合一些能夠影響生物胺產(chǎn)生的因素進(jìn)行解釋分析，如原料肉的新鮮程度和衛(wèi)生質(zhì)量、加工和成熟階段引起的微生物種類和數(shù)量的變化等。

由于生物胺存在于發(fā)酵香腸對(duì)消費(fèi)者健康造成潛在的威脅，因此酪胺、組胺、尸胺和腐胺已被建議作為發(fā)酵肉制品受腐敗微生物污染的標(biāo)志[22]。許多研究表明，尸胺和腐胺是肉制品中主要的胺類[23]，雖然它們通常不被認(rèn)為具有毒性作用，但是它們能夠增強(qiáng)一些芳香族胺的毒性作用，如酪胺和組胺；此外，它們能夠與一些胺氧化酶反應(yīng)，從而降低氧化酶降解生物胺的活性。腐胺主要是由假單胞菌產(chǎn)生的，尸胺主要是由腸桿菌產(chǎn)生的[24]。本研究中腐胺和尸胺的結(jié)果如表5所示，在0～3 d內(nèi)，兩種胺的含量平均都低于50 mg/kg，腐胺含量到成熟結(jié)束也一直保持這樣的水平，該值被Ladero等[25]報(bào)道作為安全限量。而在熏馬腸成熟后期（第28天），與空白組相比，添加大蒜精油可使尸胺和腐胺含量減少75.50%和37.98%，接種發(fā)酵劑并添加大蒜精油可使尸胺和腐胺含量分別減少75.56%、70.34%，說明大蒜精油和發(fā)酵劑的結(jié)合使用能夠大幅度抑制這兩種生物胺的產(chǎn)生。從表5可看出，接種發(fā)酵劑的S組對(duì)腐胺的影響不是很大，但Zhang Qilin等[26]研究表明添加不產(chǎn)胺的乳酸菌作為發(fā)酵劑可以降低腐胺和尸胺的積累，并且能夠快速產(chǎn)酸，抑制不受歡迎的細(xì)菌如假單胞菌和大腸桿菌等的產(chǎn)生。而添加大蒜精油的O和SO組腐胺產(chǎn)生的數(shù)量要顯著低于其他組（P＜0.05），說明可能是大蒜精油對(duì)鳥氨酸脫羧酶活性具有抑制作用，也可能是大蒜精油和發(fā)酵劑聯(lián)合使用阻礙了腐胺的產(chǎn)生。

表5 新疆熏馬腸中生物胺含量Table 5 Concentrations of biogenic amines in smoked horsemeat sausages mg/kg

從表5中可得，在熏馬腸發(fā)酵成熟的各個(gè)時(shí)期，接種發(fā)酵劑和添加大蒜精油組（S和SO組），尸胺含量比對(duì)照組（CK）平均減少了60%以上，此結(jié)果高于Simion等[20]研究在發(fā)酵香腸僅接種發(fā)酵劑對(duì)尸胺含量的影響，結(jié)果說明尸胺的形成受發(fā)酵劑的影響較大，而將大蒜精油與發(fā)酵劑相結(jié)合，對(duì)產(chǎn)生尸胺的微生物起到了良好的抑制效果。朱志遠(yuǎn)[27]研究稱pH值對(duì)氨基酸脫羧酶活性具有很大的影響。在熏馬腸中快速降低pH值，能夠抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，特別對(duì)于腸細(xì)菌作用最顯著，因此其尸胺含量也顯著低于其他胺類。而接種產(chǎn)胺菌組對(duì)尸胺的產(chǎn)生影響不大，說明屎腸球菌和糞腸球菌不是主要產(chǎn)生尸胺的菌種。

已有大量研究表明，組胺的產(chǎn)生與尸胺和腐胺有關(guān)，尤其與尸胺關(guān)系更為密切，因?yàn)樗鼈兌贾饕赡c細(xì)菌產(chǎn)生[28]。從表5可以看出，各個(gè)時(shí)期的8 組熏馬腸樣品中組胺含量都不超過50 mg/kg，遠(yuǎn)低于一些學(xué)者提出的發(fā)酵肉制品中組胺的最低限量100 mg/kg[29]。接種發(fā)酵劑和添加大蒜精油的熏馬腸中組胺的含量顯著少于空白對(duì)照組（P＜0.05），且在第28天時(shí)，組胺含量相較對(duì)照組減少了68.88%，說明發(fā)酵劑和大蒜精油在抑制組胺形成過程中具有一定作用。

酪胺在食物中引起中毒的劑量范圍為100～800 mg/kg[30]，而本實(shí)驗(yàn)8 組熏馬腸樣品只有J組在發(fā)酵結(jié)束時(shí)酪胺的含量最高為117 mg/kg，而且即使在接種發(fā)酵劑或添加大蒜精油的樣品中，酪胺的含量也都在75 mg/kg以上，說明酪胺主要是由屎腸球菌和糞腸球菌等乳酸菌產(chǎn)生的，Pircher等[31]研究也認(rèn)為，酪胺的累積通常與一些污染菌如非發(fā)酵型乳酸菌有關(guān)，特別是腸球菌屬；Linares等[32]也曾報(bào)道稱酪胺通常是由一些具有生物胺脫羧酶活性的乳酸菌屬產(chǎn)生的，如彎曲乳桿菌、短乳桿菌等。高濃度的酪胺通常在發(fā)酵階段產(chǎn)生，并且與Parente等[33]報(bào)道相似。在成熟第28天，接種發(fā)酵劑和添加大蒜精油的樣品酪胺平均含量為30 mg/kg，而接種產(chǎn)胺菌組酪胺含量平均在78 mg/kg，都沒超過酪胺在食品中規(guī)定的限量。

通常苯乙胺是伴隨著大量的酪胺出現(xiàn)的[34]，有些學(xué)者認(rèn)為苯乙胺是有非特異活性的酪氨酸脫羧酶形成的，而Montel等[35]則報(bào)道稱該胺是由腸球菌和乳酸菌（彎曲乳桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌）產(chǎn)生的。由表5中可以看出，原料肉中苯乙胺的含量非常低，說明該生物胺不是內(nèi)源性胺。而大量的苯乙胺的形成是在發(fā)酵結(jié)束第3天時(shí)，接種產(chǎn)胺菌組中的苯乙胺含量要顯著高于未接種產(chǎn)胺菌組（P＜0.05），經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大蒜精油對(duì)產(chǎn)胺菌產(chǎn)生物胺的抑制作用要優(yōu)于發(fā)酵劑，而聯(lián)合使用效果最佳。在Gücüko?lu等[16]研究中也證實(shí)了接種發(fā)酵劑能夠阻礙苯乙胺的形成。在成熟結(jié)束后，接種產(chǎn)胺菌平均可產(chǎn)生苯乙胺39.78 mg/kg、酪胺5.35 mg/kg，只添加大蒜精油或接種發(fā)酵劑可使苯乙胺含量分別減少60.88%和68.57%，使酪胺含量分別減少61.31%和57.38%，接種發(fā)酵劑和添加大蒜精油組的熏馬腸中苯乙胺含量在11.55～18.20 mg/kg之間，稍高于Gücüko?lu等[16]的研究結(jié)果，但與Bover-Cid等[36]測(cè)定的苯乙胺在發(fā)酵香腸中的含量5～45 mg/kg相近。

精胺和亞精胺是天然存在的胺類，它們會(huì)經(jīng)常存在于新鮮的肉中。它們既會(huì)出現(xiàn)在用于制作香腸的瘦肉中，也會(huì)存在于脂肪里。并且它們受香腸成熟過程中的影響變化非常小，精胺和亞精胺的含量在加工成熟過程中幾乎保持不變，甚至精胺會(huì)被某些微生物當(dāng)作氮源利用導(dǎo)致含量降低。從表5中可以看出，所有組的熏馬腸樣品中精胺和亞精胺的含量都相當(dāng)?shù)?，而且各組之間的差異性不顯著（P＞0.05），說明使用的原料肉中自身所含的精胺和亞精胺就相對(duì)較少。

3 結(jié) 論

將大蒜精油和發(fā)酵劑聯(lián)合使用能夠很好地減少熏馬腸中尸胺、腐胺、組胺、酪胺和苯乙胺的產(chǎn)生，對(duì)控制生物胺在熏馬腸中的含量起到非常顯著的作用。添加大蒜精油可使尸胺和腐胺含量減少75.50%和37.98%；接種發(fā)酵劑并添加大蒜精油尸胺、腐胺和組胺含量平均減少75.56%、70.34%和68.88%。接種產(chǎn)胺菌平均可產(chǎn)生苯乙胺39.78 mg/kg、酪胺5.35 mg/kg；只添加大蒜精油或接種發(fā)酵劑可使苯乙胺含量分別減少60.88%和68.57%，使酪胺含量分別減少61.31%和57.38%；而復(fù)合添加物可苯乙胺和酪胺含量平均減少75.17%和63.30%。

將41 個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析共產(chǎn)生276 個(gè)OTU，說明熏馬腸中含有豐富的微生物物種，通過樣品科分類水平中物種分析，得出乳酸菌在熏馬腸整個(gè)加工過程都是優(yōu)勢(shì)菌，而葡萄球菌在成熟后期數(shù)量較多。大蒜精油對(duì)一些腐敗菌如大腸桿菌、假單胞菌具有一定的抑制作用，加之發(fā)酵劑中的乳酸菌迅速產(chǎn)酸，從而減少了生物胺在熏馬腸中的積累。

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