支亞麗，張?jiān)娒?，栗俊杰，譚志容，李樹隆，莊 嚴(yán)

(深圳市蛇口人民醫(yī)院，廣東 深圳518067)

微小RNA(microRNA,miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的、內(nèi)源性的、具有調(diào)控功能的大小約20-25個堿基的非編碼RNA[1]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠穩(wěn)定存在于血液、尿液、唾液、乳汁、眼淚、分泌物等多種體液中[2]。一些miRNA對某些腫瘤具有特異性，因此，miRNA是一種良好的生物標(biāo)志物，對腫瘤的診斷、評價療效、預(yù)后等有很好的指導(dǎo)意義。宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，是由宮頸不典型增生逐步發(fā)展到原位癌，再進(jìn)一步惡化為宮頸癌。因此宮頸癌的早期診斷對治療與預(yù)后十分重要。研究表明，miR-21在乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤患者的血清中表達(dá)明顯升高[3]，這其中也包括宮頸癌。本研究通過SYBR Green熒光定量PCR法檢測宮頸粘液脫落細(xì)胞標(biāo)本中的mi-21的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)正常組與宮頸上皮內(nèi)瘤變組、宮頸癌組中miR-21的表達(dá)水平存在明顯差異。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集

深圳市蛇口人民醫(yī)院收治的門診、住院病人以及健康體檢者宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本共90例，其中宮頸癌30例，年齡32-58歲；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變30例，年齡31-59歲；正常組30例，年齡30-59歲。

1.2 儀器與試劑

All-in-OneTMmiRNA第一鏈cDNA合成試劑盒與All-in-OneTMmiRNA qPCR檢測試劑盒、miR-21引物以及內(nèi)參U6引物購于中國廣州復(fù)能基因公司， TRIzol購于TAKARA。低溫離心機(jī)為Eppendorf 5230R，熒光定量PCR儀為羅氏Z480。

1.3 方法

1.3.1總RNA提取

取500 μl宮頸粘液上皮細(xì)胞標(biāo)本于EP管中，加入500 μl TRIzol(TAKARA，日本)裂解細(xì)胞，為使細(xì)胞完全裂解，需要用移液槍反復(fù)吹打裂解液，吹打完成后，將EP管靜置5 min；在 EP管中加入0.1 ml的氯仿，為使有機(jī)相與水相充分反應(yīng)，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15 s，待溶液充分乳化(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置10 min；低溫離心機(jī)(Eppendorf 5230R)程序設(shè)置溫度為4℃，12,000 g離心15 min。離心結(jié)束后，從離心機(jī)中慢慢取出EP管，不要搖晃EP管，這個時候可看到EP管中的液體分為3層，上層是上清液，無色透明，RNA即存在于此層。中間可見一小層白色的乳狀物，即蛋白，下層為紅色的有機(jī)層，RNA存在于上清液中。盡量多地吸取上清液到另一新的RNase free離心管中。沉淀RNA：加入與吸的上清液大致等體積的異丙醇，輕柔地來回顛倒，使其充分混勻，室溫靜置10 min；低溫離心機(jī)4℃下，12,000 g離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用無水乙醇與DEPC水配置75%乙醇，加入0.5 ml-1 ml 75%乙醇洗滌，低溫離心機(jī)4℃下，12,000 g離心5 min，去上清，將EP管超凈臺風(fēng)干，待白色沉淀逐漸變透明后加入15-50 μl DEPC水溶解。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取總RNA后，測提取的RNA濃度，以總RNA為2 μg算出加RNA模板的體積。按照試劑說明書添加體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(復(fù)能基因，廣州)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 miRNA逆轉(zhuǎn)錄體系為：5 μl 的5×PAP/RT Buffer；1 μl 的2.5 U/μl Poly A Polymerase；2 μg的RTase Mix 1 μl Total RNA；補(bǔ)RNase Free dH2O配成25 μl。PCR儀反應(yīng)條件設(shè)定為：37℃，60 min；85℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入100 μl dH2O稀釋5倍后用于miRNA熒光定量檢測。

1.3.3miRNA熒光定量PCR

按照試劑說明書(復(fù)能基因，廣州)，配置熒光定量PCR反應(yīng)液。反應(yīng)體系為10 μl的2×All-in-OneTM； 2 μl 的qPCR Mix Universal Adaptor PCR Primer；2 μl 的All-in-OneTMmiRNA qPCR Primer，2 μl 的First-strand cDNA(diluted 1∶5)，dH2O 4.0 μl。反應(yīng)條件為95℃，10 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，30 s，共40個循環(huán)。PCR儀為羅氏Z480。以U6作為內(nèi)參microRNA，通過2-△△Ct來評價目標(biāo)mRNA的表達(dá)水平，△△Ct=(標(biāo)本Ct目的-標(biāo)本內(nèi)參)-(對照Ct目的-對照內(nèi)參)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件中的Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線采用Graphpad制作分析。

2 結(jié)果

2.1 各組宮頸粘液上皮細(xì)胞中miR-21的表達(dá)情況

用SYBR Green熒光定量PCR法檢測各組宮頸粘液脫落細(xì)胞標(biāo)本中的mi-21的表達(dá)情況。由于各組均不滿足參數(shù)檢驗(yàn)的條件，故使用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。由圖1所示，miR-21在正常組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組、宮頸癌組中相對表達(dá)中位數(shù)分別2.8733、13.3643、14.2617。miR-21在宮頸上皮內(nèi)瘤變組明顯高于正常組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.027，P<0.001)；宮頸癌組miR-21的表達(dá)相對正常組也明顯升高(Z=-5.648，P<0.001)。而miR-21的表達(dá)在宮頸上皮內(nèi)瘤變組與宮頸癌組之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.198，P=0.231)。

圖1 miR-21在正常組(Normal)、宮頸上皮內(nèi)瘤變組(CIN)、宮頸癌組(CANCER)的表達(dá)水平

2.2 miR-21的ROC曲線分析

如表1所示，miR-21區(qū)別正常組與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組的ROC曲線面積為0.87(95%CI:0.793 5-0.962 1；P<0.001)，當(dāng)臨界值為7.060時，敏感度為80%，特異度為80%，約登指數(shù)為60%。

表1 miR-21對宮頸上皮瘤變、宮頸癌的診斷價值ROC分析結(jié)果

如表1所示，miR-21區(qū)別正常組與宮頸癌組的ROC曲線面積為0.92(95%CI:0.859 0-0.989 9；P<0.001)，當(dāng)臨界值為7.508時，敏感度為93.33%，特異度為80%，約登指數(shù)為73.33%。

3 討論

微小RNA(microRNA,miRNA)是內(nèi)源性的、具有調(diào)控功能的非編碼RNA，由約20-25個堿基組成。miRNA能通過與靶 mRNA 的特異性堿基配對引起靶 mRNA 的降解、抑制或活化,對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1]。miRNA可通過調(diào)控細(xì)胞的癌基因和抑癌基因，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲和預(yù)后等形成過程。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明大多數(shù)人類腫瘤中都存在miRNA的異常表達(dá)，而miRNA又可穩(wěn)定地存在于人類各種體液中，因此可作為腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的診斷與監(jiān)測。

miR-21位于人類染色體脆性位點(diǎn)FRA17B上，該位點(diǎn)與腫瘤密切相關(guān)[4]。因此，miR-21在大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)增高。在宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中，miR-21可抑制其靶基因PDCD4的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]；miR-21也可通過抑制TIMP3的表達(dá)，促進(jìn)HeLa細(xì)胞生長，抑制其凋亡[6]。Yao等發(fā)現(xiàn)，miR-21在宮頸癌組織中表達(dá)增高，并且miR-21可通過調(diào)控CCL20基因，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展[7]。miR-21還可抑制PTEN表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖[8]。血清中的循環(huán)miR-21與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。

由于miRNA被證明能穩(wěn)定存在于血清、尿液等各種體液中，因此近些年來miRNA作為疾病新型生物標(biāo)志物用于診斷疾病成為了研究熱點(diǎn)。研究表明，miR-21在宮頸癌組織的表達(dá)高于正常宮頸組織。在宮頸癌患者的血清中的miR-21的表達(dá)量明顯高于非宮頸癌患者。然而，血清或血漿中的miR-21可在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)：如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、肺癌等等，除此之外，miR-21還可在非腫瘤疾病患者的血清中表達(dá)異常：如肝炎、糖尿病等。因此血清中的miR-21的異常表達(dá)并不能針對性地反映某種疾病，不具備某種疾病的特異性[3]。

本研究通過實(shí)時熒光定量PCR檢測宮頸癌脫落細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)宮頸粘液脫落細(xì)胞標(biāo)本中的miR-21在宮頸癌與癌前病變患者表達(dá)升高(P<0.001)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-21可區(qū)分正常組和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組，其ROC曲線面積為0.87，說明診斷價值中等，其敏感度為80%，特異度為80%。miR-21在正常組和宮頸癌組的ROC曲線面積為0.92，說明診斷價值較高，其敏感度為93.33%，特異度為80%。

綜上所述，宮頸粘液脫落細(xì)胞中的miR-21對宮頸癌及其癌前病變具有診斷價值。而宮頸粘液脫落細(xì)胞標(biāo)本有著無創(chuàng)、易于取樣、易于檢測等特點(diǎn)，而且相對于血清標(biāo)本，對宮頸癌更具有特異性。因此，宮頸粘液脫落細(xì)胞中的miR-21可以作為宮頸癌篩查與診斷以及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，但是尚需進(jìn)一步的大樣本臨床驗(yàn)證。

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