鄧 婧,馬小涵,趙天天,易繼武,劉 雄,,*
(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.昌都市君親農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司,西藏 昌都 854000)
青稞即裸大麥,主產(chǎn)于我國青海、青藏高原等地,具有高蛋白質(zhì)、高膳食纖維、低脂、低糖等特點[1]。青稞含有豐富的β-葡聚糖(β-glucan,BG),平均含量為5%,遠高于其他谷類作物[2]。BG是一類高分子黏性多糖,也是一種水溶性膳食纖維[3]。有研究指出,BG在腸道內(nèi)形成黏性溶液能阻礙淀粉分解和糖類吸收,從而延緩淀粉消化和血糖濃度升高,具有降低餐后血糖和胰島素水平的效果[4-9]。青稞相對大多數(shù)谷物具有較低的血糖生成指數(shù)和淀粉消化率,更有益于人體健康,這與其中的BG密切相關[10]。
目前關于青稞BG的研究多集中在提取工藝的改進和理化性質(zhì)的研究[11-17],關于青稞BG對淀粉體外消化性影響的研究鮮見報道。因此,本實驗選擇日常主食中重要的糧食品種小麥粉作為對照,在對比青稞全粉和小麥粉體外消化性基礎上,進一步研究青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量對青稞淀粉體外消化性的影響,從青稞BG流變學特性及其與α-淀粉酶的相互作用方面,研究青稞BG抑制淀粉消化機理,旨在為青稞降血糖機理提供理論參考。
青稞全粉由昌都市君親農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供,將青稞去殼后粉碎過80 目篩得到青稞全粉;普通小麥粉 五得利集團;耐高溫α-淀粉酶 阿拉丁試劑有限公司;α-淀粉酶(A3403,酶活力500 U/mg)、胃蛋白酶(P7000,酶活力250 U/mg)、胰酶(P7545,酶活力8 U/mg)、Dextran系列葡聚糖 美國Sigma公司;交聯(lián)BG測定試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司;透析袋(1 000 u) 北京索萊寶科技有限公司;凝膠色譜儀、TSK gel G6000PWXL色譜柱 日本Tosoh公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。
HH-4恒溫水浴鍋 上海青浦滬西儀器廠;JJ-1電動攪拌器 金壇市科析儀器公司;PHS-3C型酸度計 上海三信儀表廠;4K15型高速離心機 美國Sigma公司;LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技公司;納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司;UV-2450型紫外分光光度計、LC-20A型液相色譜儀 日本島津公司;F-2500型熒光分光光度計 日本日立公司;DHR-1型流變儀 美國TA儀器公司。
1.3.1 青稞BG的分離純化
青稞BG的分離純化在文獻方法[18-20]基礎上進行一些改進。青稞全粉中按照料液比1∶8(g/mL)加入75%乙醇溶液,80 ℃回流2 h,冷卻后棄上清液,再加入無水乙醇浸沒濕粉15 min,去除乙醇,70 ℃烘干待用,以脫脂和除內(nèi)源酶。稱取一定量脫脂、滅酶后的青稞全粉,按照料液比1∶15(g/mL)加入蒸餾水,調(diào)pH 8.0并于80 ℃攪拌提取2 h,6 000 r/min離心20 min,收集上清液;調(diào)pH 6.4,按照2 U/mL加酶量加入耐高溫α-淀粉酶,于90 ℃恒溫水浴40 min;待溶液冷卻后,調(diào)pH 8.0,按體積比50∶1加入1%胰蛋白酶溶液,于37 ℃恒溫水浴30 min后滅酶,待溶液冷卻后,調(diào)pH 4.5,4 ℃靜置過夜;6 000 r/min離心20 min,收集上清液,上清液減壓濃縮至原體積1/2,加入溶液4 倍體積的95%乙醇溶液,4 ℃靜置過夜,6 000 r/min離心20 min,收集沉淀并以蒸餾水復溶,再于1 000 u透析袋透析72 h,將透析液減壓濃縮后加入溶液4 倍體積95%乙醇溶液,6 000 r/min離心20 min,收集沉淀并冷凍干燥,即得青稞BG。
1.3.2 青稞淀粉的提取
青稞淀粉的提取在文獻方法[21-23]基礎上進行一些改進。青稞全粉中按照料液比1∶5(g/mL)加入0.5%的NaOH溶液,于40 ℃攪拌提取4 h,調(diào)溶液pH 7.0,5 000 r/min離心10 min,棄上層濃稠液體,刮去上層褐色沉淀,取下層沉淀加水制漿,過200 目篩,5 000 r/min離心10 min,棄上清液,刮去上層灰色沉淀,收集下層白色沉淀,分別用95%乙醇和蒸餾水各洗滌3 次,離心收集沉淀并冷凍干燥,即得青稞淀粉。
1.3.3 不同分子質(zhì)量青稞BG的制備
采用酸水解法[5]制備不同分子質(zhì)量青稞BG。分別配制2%青稞BG溶液,用5 mol/L磷酸作為酸解液并調(diào)節(jié)溶液pH 2.0,于80 ℃恒溫水浴中水解不同時間(15、30、60 min和120 min)。調(diào)pH 7.0,加入溶液4 倍體積95%乙醇溶液,6 000 r/min離心20 min,收集沉淀并以蒸餾水復溶,再于1 000 U透析袋透析72 h,將透析液減壓濃縮后加入溶液4 倍體積95%乙醇溶液,6 000 r/min離心20 min,收集沉淀并冷凍干燥,即得不同分子質(zhì)量青稞-BG。
1.3.4 基本組分測定
脂肪含量測定:GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》;蛋白質(zhì)含量測定:GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》;淀粉含量測定:GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》;粗纖維含量測定:GB/T 5515—2008《糧食中粗纖維素含量測定 介質(zhì)過濾法》;BG含量測定:NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》;還原糖含量測定:3,5-二硝基水楊酸比色法。
1.3.5 青稞BG分子質(zhì)量的測定
采用高效凝膠色譜法,分析條件為:LC-20A型液相色譜系統(tǒng),TSK gel G6000PWXL凝膠色譜柱,示差折光檢測器,流動相超純水,柱溫30 ℃,流速0.7 mL/min,進樣量20 μL。
1.3.6 青稞BG粒徑分析
使用納米粒度及Zeta電位儀分析不同分子質(zhì)量1 mg/mL青稞BG溶液粒度分布,測定前溶液需超聲分散1 min。
1.3.7 青稞BG流變學性質(zhì)研究
靜態(tài)剪切速率與黏度關系掃描,測定條件為:夾具40 mm,2 °椎板,溫度37 ℃,應變力為1.0%,剪切速率0.1~100 s-1,采集變量點數(shù)目為60 個。然后用牛頓冪律方程進行擬合。擬合公式如下:
式中:δ為剪切應力/Pa;γ為剪切速率/s-1;K為稠度系數(shù)/(Pa·s-n);n為流體行為指數(shù),其大小表示液體偏離牛頓指數(shù)的程度,n小于1時樣品溶液為剪切變稀的假塑性,n為1時,溶液為牛頓流體,n大于1時,為脹塑性流體。
動態(tài)黏彈性掃描,測定條件為:夾具40 mm,2 °椎板,溫度37 ℃,應變力為1.0%,角頻率0.1~100 rad/s,采集變量點數(shù)目為20 個。然后用牛頓冪律方程進行擬合。擬合公式如下:
式中:ω為角頻率;G’為彈性模量;G”為黏性模量;K’、K”、n’、n”均為擬合參數(shù)。
1.3.8 青稞BG對α-淀粉酶的熒光淬滅作用[24-26]
采用10 mm光徑的四面通光石英比色皿,設置固定激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度為5 nm,分別掃描不含青稞BG、含有不同質(zhì)量濃度青稞BG和不同分子質(zhì)量青稞BG的0.5 mg/mL α-淀粉酶在300~400 nm波長范圍的熒光光譜。
1.3.9 青稞全粉體外模擬消化實驗[27]
分別取10 g青稞全粉和小麥粉,加入一定量蒸餾水于沸水浴中糊化5 min,均質(zhì)處理后加入模擬人工唾液1.6 mL(α-淀粉酶質(zhì)量濃度為1.3 mg/mL),于37 ℃恒溫振蕩搖床中振蕩10 min;調(diào)消化液pH 1.2,加入模擬人工胃液20 mL(胃蛋白酶質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL),于37 ℃恒溫振蕩搖床中振蕩2 h(120 r/min);調(diào)消化液pH 6.8,加入模擬人工腸液2 mL(胰酶質(zhì)量濃度為10 mg/mL),于37 ℃恒溫振蕩搖床中振蕩2 h(120 r/min),冰浴中冷卻終止反應,調(diào)消化液pH值中性;消化液于6 000 r/min離心20 min,收集上清液并定容,采用DNS法測定消化液中還原糖含量,以淀粉水解率表示對淀粉消化的程度,以小麥粉作對照。淀粉水解率公式如下:
1.3.10 青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量對青稞淀粉消化性影響實驗
分別取2 g青稞淀粉,加入一定量蒸餾水于沸水浴中糊化5 min,分別加入50 mL同分子質(zhì)量不同質(zhì)量濃度(5、10、15、20 mg/mL)和同質(zhì)量濃度(10 mg/mL)不同分子質(zhì)量的青稞BG溶液,后續(xù)操作同1.3.9節(jié)。
采用Microsoft Excel和SPSS分析軟件對數(shù)據(jù)進行整理與分析,結果均以 ±s表示,實驗重復次數(shù)n=3。
選擇具有代表性的小麥粉作為對照,比較青稞全粉和小麥粉基本成分和體外消化性。由表1可知,青稞全粉中淀粉含量顯著低于小麥粉(P<0.05),膳食纖維和BG含量顯著高于小麥粉(P<0.05)。
表1 青稞全粉、小麥粉基本成分和體外淀粉水解率比較Table 1 Comparison of main components and starch digestibility in vitro of highland barley and wheat flour
以小麥粉作為對照,連續(xù)模擬青稞全粉在口腔、胃和小腸中的消化過程。青稞全粉中淀粉水解率(82.83±2.12)%顯著低于普通小麥粉中淀粉水解率(93.06±3.19)%(P<0.05),表明青稞全粉中淀粉體外消化率低于小麥粉中淀粉體外消化率。谷物在唾液淀粉酶、胰酶的作用下,谷物中的淀粉被水解,不同谷物由于成分上的差異造成其消化程度不同。同一條件下,青稞全粉中淀粉水解率顯著低于普通小麥粉中淀粉水解率,這可能是由于青稞全粉中較高含量的膳食纖維(BG等非淀粉多糖)影響淀粉的消化性所致。為探究這一可能性,分別提取青稞BG和青稞淀粉進行體外模擬消化實驗,驗證這一猜想。
圖1 青稞BG質(zhì)量濃度對青稞淀粉體外消化性的影響Fig. 1 Effect of highland barley β-glucan at different concentrations on starch digestibility in vitro
如圖1所示,青稞淀粉消化分解生成的還原糖含量(單位為mg)按從大到小排序為:904.98±5.44(空白組)>845.05±5.04(5 mg/mL BG)>792.38±3.14(10 mg/mL BG)>756.06±8.32(15 mg/mL BG)>692.49±14.41(20 mg/mL BG)。隨青稞BG質(zhì)量濃度增加,青稞淀粉消化分解生成的還原糖逐漸降低,且顯著低于空白對照組(P<0.05),這表明青稞BG質(zhì)量濃度越大,青稞淀粉消化越慢,青稞BG能夠部分抑制青稞淀粉消化程度,提高青稞淀粉的抗消化性。這可能是由于隨青稞BG質(zhì)量濃度增加,消化液黏度增大,流動性降低,青稞BG易形成凝膠部分覆蓋在淀粉顆粒表面,阻礙α-淀粉酶與淀粉顆粒接觸,增加淀粉酶酶解阻力,使青稞淀粉分解速率變慢。
如表2所示,青稞BG的分子質(zhì)量和粒徑均隨著水解時間延長而降低。不同分子質(zhì)量青稞BG對青稞淀粉體外消化性的影響情況如圖2所示,加入相同質(zhì)量濃度(10 mg/mL)不同分子質(zhì)量的青稞BG,青稞淀粉消化分解生成的還原糖含量(單位:mg)按從大到小排序為:888.63±18.11(空白組)>785.11±14.44(BG-120)>752.42±5.44(BG-60)>736.08±5.45(BG-30)>725.18±8.29(BG-15)>687.04±13(BG-0)。青稞BG分子質(zhì)量越大,青稞淀粉消化分解生成的還原糖越少,且顯著低于空白對照組(P<0.05)。這可能是由于青稞BG分子質(zhì)量越大,溶液黏度越大,分子質(zhì)量降低會導致青稞BG溶液黏度降低。同一質(zhì)量濃度下,青稞BG分子質(zhì)量越大的溶液黏度越高,溶液黏滯阻力越大,對消化酶的屏障作用越強,抑制淀粉消化程度越顯著。
表2 不同分子質(zhì)量青稞BG的平均分子質(zhì)量和平均粒徑Table 2 Average molecular mass and particle size of different highland barley β-glucans
圖2 青稞BG分子質(zhì)量對青稞淀粉體外消化性的影響Fig. 2 Effect of highland barley β-glucans with different molecular masses on starch digestibility in vitro
不同質(zhì)量濃度、分子質(zhì)量青稞BG溶液的剪切流動性和黏彈性及流變曲線牛頓冪律擬合參數(shù)分別見圖3、表3。由圖3A、B可知,不同質(zhì)量濃度、分子質(zhì)量的青稞BG溶液表觀黏度均隨剪切速率的增加而降低,流體指數(shù)n小于1,表現(xiàn)為典型的非牛頓假塑性流體行為。同一剪切速率下,青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量越大,溶液表觀黏度越大。由表3可知,稠度系數(shù)與青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量均呈正相關。
由圖3C、4D可知,不同質(zhì)量濃度、分子質(zhì)量的青稞BG的G’和G”均隨角頻率增加而增加,且青稞BG質(zhì)量濃度越高,分子質(zhì)量越大,溶液G’和G”越大。由表3可知,稠度系數(shù)K’和K”與青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量均呈正相關,這說明高質(zhì)量濃度、高分子質(zhì)量的青稞BG溶液具有更強的黏彈性表現(xiàn),這可能是因為高質(zhì)量濃度、高分子質(zhì)量的青稞BG分子間相互作用更強。不同質(zhì)量濃度青稞BG溶液G′擬合的冪律方程斜率(n’=0.85~1.26)大于G”擬合后的斜率(n”=0.55~0.84),不同分子質(zhì)量青稞BG溶液G’擬合的冪律方程斜率(n’=0.62~1.21)大于G”擬合后的斜率(n”=0.56~1.06),這說明青稞BG彈性貢獻隨角速率的增大而增大的程度強于黏性貢獻,表明青稞BG凝膠具備較強韌的凝膠結構。綜上,青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量變化對溶液黏彈性有顯著影響,從而在2.2節(jié)和2.3節(jié)中表現(xiàn)出對青稞淀粉體外消化影響不同的差異。
圖3 不同質(zhì)量濃度、不同分子質(zhì)量青稞BG溶液的剪切流動性和黏彈性Fig. 3 Flowability and viscoelasticity of highland barley β-glucan solutions at different concentrations and molecular masses
表3 不同質(zhì)量濃度、不同分子質(zhì)量BG溶液流變曲線牛頓冪律擬合參數(shù)Table 3 Power law fitting parameters for highland barley β-glucan solutions at different concentrations and molecular masses
圖4 不同質(zhì)量濃度青稞BG與α-淀粉酶相互作用的熒光光譜Fig. 4 Effect of highland barley β-glucan at different concentrations on fluorescence spectra of α-amylase
圖5 不同分子質(zhì)量青稞BG與α-淀粉酶相互作用的熒光光譜Fig. 5 Effect of highland barley β-glucan with different molecular masses on fluorescence spectra of α-amylase
蛋白質(zhì)中色氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光[28],而α-淀粉酶分子含有至少16 個色氨酸殘基[29],因此α-淀粉酶色氨酸殘基的天然熒光及其變化值可直接反映蛋白質(zhì)本身和周圍環(huán)境的變化。由圖4可知,在280 nm激發(fā)波長下,α-淀粉酶在337 nm波長處有最大熒光發(fā)射峰,且隨著青稞BG質(zhì)量濃度的不斷增大,α-淀粉酶熒光發(fā)射峰強度逐漸減弱。由此可見,青稞BG對α-淀粉酶有熒光猝滅作用,可能是由于青稞BG與蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基發(fā)生靜電和氫鍵相互作用,微擾α-淀粉酶的構象,使色氨酸殘基所處的疏水微環(huán)境發(fā)生明顯變化[28]。此外,由圖5可知,同一質(zhì)量濃度下,隨青稞BG分子質(zhì)量增加,α-淀粉酶在337 nm波長處熒光發(fā)射峰強度逐漸降低,淬滅作用程度增加??赡苁怯捎谇囡鼴G分子質(zhì)量大小影響α-淀粉酶微結構和抑制作用,青稞BG分子質(zhì)量降低,對α-淀粉酶熒光淬滅作用降低,抑制α-淀粉酶效果下降[30]。
本研究結果表明:青稞全粉中淀粉消化率顯著低于小麥粉中淀粉消化率,具有低血糖功效,這與其中的BG密切相關。青稞BG質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量越大,溶液黏度和彈性越大,延緩青稞淀粉消化效果越顯著。高質(zhì)量濃度、高分子質(zhì)量的青稞BG溶液易形成凝膠覆蓋在淀粉顆粒表面,阻礙淀粉酶與淀粉顆粒接觸,從而抑制淀粉的消化。此外,青稞BG形成的高黏性溶液環(huán)境對α-淀粉酶構象和所處的微環(huán)境有一定影響,使α-淀粉酶活性部分被抑制,且青稞BG質(zhì)量濃度越高、分子質(zhì)量越大,抑制效果越明顯。青稞BG能抑制淀粉消化、降低餐后血糖,青稞BG可作為功能性成分,應用于降血糖和保健食品等領域。
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