韓 霜，馬 良，楊 暉，黃丹丹，張宇昊,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 400715）

明膠來源于動物皮、筋、骨骼中的膠原蛋白質(zhì)，是膠原蛋白質(zhì)部分水解的產(chǎn)物。由于其具有諸多優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)，如可形成可逆性凝膠、流變性、表面活性等常被作為膠凝劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和澄清劑，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1]。目前，大部分明膠來源于牛皮、豬皮與牛骨等，水產(chǎn)明膠作為明膠來源之一，僅在小規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用[2]。但隨著瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發(fā)，及一些宗教的限制，魚明膠作為哺乳明膠的潛在替代品，受到了越來越多的關(guān)注，且需求量逐漸增加[3]。

漁場等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的廢棄物主要有魚皮、魚骨、魚鱗、魚鰭等，這些副產(chǎn)物都可以作為原料經(jīng)過一定條件的預(yù)處理后加工制備成水產(chǎn)明膠。已有許多關(guān)于水產(chǎn)明膠的報道，所涉及的品種非常廣泛，包括阿拉斯加鱈魚[4]、太平洋鱈魚[5]、綠青鱈[6]、三文魚[7]等冷水魚，及羅非魚[8]、草魚[9]、魷魚[10]、金槍魚[11]等溫水魚?？傮w來說，同哺乳動物明膠相比，水產(chǎn)明膠的凝膠特性較差[12]。尤其是冷水魚明膠很難完全替代哺乳動物明膠使用，原因在于其亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（約17%）遠(yuǎn)低于哺乳動物明膠。而溫水魚明膠中亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（22%～25%）與哺乳動物明膠亞氨基酸（30%左右）相近，明膠凝膠特性也更為接近，因此溫水魚明膠更適合作為哺乳動物明膠的替代品被深入開發(fā)。

金槍魚又名鮪魚、吞拿魚，廣泛分布于太平洋、大西洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶廣闊水域，屬于大洋暖水性洄游魚類。金槍魚肉脂肪低、熱量低，含有豐富的氨基酸，同時還含有大量的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，因而備受推崇。作為加工副產(chǎn)物，金槍魚皮富含膠原蛋白，是制備明膠的良好原材料。目前，對于黃鰭金槍魚皮明膠的制備及性質(zhì)方面已經(jīng)有一些報道。Cho等[11]最先以黃鰭金槍魚皮為原料提取明膠，優(yōu)化提取工藝，并研究所得明膠的凝膠強(qiáng)度、膠凝溫度與熔化溫度和動態(tài)黏彈性等。Han Yuna等[13]通過研究黃鰭金槍魚皮明膠酶水解產(chǎn)物的生物活性發(fā)現(xiàn)，黃鰭金槍魚皮明膠及其水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化性，可以用作具有強(qiáng)效抗氧化、抗癌和抗高血壓的功能性食品或藥物成分。除黃鰭金槍魚外，大目金槍魚也是金槍魚常見品種之一，資源十分豐富。僅2013年，整個太平洋海域的大目金槍魚產(chǎn)量就達(dá)到26.0×104t，占當(dāng)年三大洋總捕撈量的59.8%[14]，且其產(chǎn)量仍然呈上升趨勢。但目前對于大目金槍魚皮明膠方面的研究鮮見報道。

因此本實(shí)驗(yàn)以大目金槍魚皮為原料提取明膠，分析所制備明膠的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性，包括凝膠強(qiáng)度、氨基酸組成、紫外和紅外光譜特征、分子質(zhì)量分布等，并與豬皮明膠進(jìn)行對比，旨在為合理利用大目金槍魚皮資源及尋找更好的哺乳動物明膠替代品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚皮 山東中魯遠(yuǎn)洋（煙臺）食品有限公司（捕撈海域：太平洋FAO 77海域）；豬皮明膠（貨號V900863，膠凝強(qiáng)度300 g） 美國Sigma公司；羥脯氨酸 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、三水·N-對甲苯磺酰胺鈉鹽（氯胺T）、高氯酸、異丙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 成都市科龍化工試劑廠；對二甲氨基苯甲醛天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Tris、過硫酸銨、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、R-250考馬斯亮藍(lán)、甘氨酸（Gly）、溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB） 生工生物工程（上海）股份有限公司；丙烯酰胺（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%） 北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量10～200 kDa） 加拿大Fermentas公司；Tris、R-250考馬斯亮藍(lán)、30%丙烯酰胺為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003B型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠；8002型溫控水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；101-4-S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HX-1005型恒溫循環(huán)器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CT3型質(zhì)構(gòu)儀美國博勒飛公司；752型紫外-可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；DHR-1型流變儀 美國TA公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀 美國Bio-Rad公司；G:BOX EF凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；Spectrun100型紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚皮明膠的制備

明膠的制備參照Karayannakidis等[4]的方法并略作調(diào)整。魚皮經(jīng)去鱗、去骨洗凈后，剪碎、漂洗瀝干，以SDS超聲脫脂2 h，水洗后，以0.8%氫氧化鈉溶液處理1 h，每30 min換一次液，水洗，以2.2%乙酸溶液處理2 h。水洗至pH值至4.5左右，在55 ℃條件下提膠6 h，濾除皮渣后，抽濾，60 ℃烘干24 h，得到明膠成品。

1.3.2 明膠凝膠強(qiáng)度的測定

參照GB 6783—2013《食品添加劑 明膠》中凝膠強(qiáng)度的測定方法，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.67%的明膠溶液，并在（10±0.1）℃恒溫循環(huán)器中放置16～18 h，采用CT-3質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠強(qiáng)度。選用TA5圓柱型探頭，下壓速率1 mm/s，下壓距離4 mm，測定明膠多個不同位置的凝膠強(qiáng)度，得出凝膠強(qiáng)度數(shù)值，計算平均值，結(jié)果取整數(shù)。

1.3.3 明膠的膠凝溫度和熔化溫度的測定

采用DHR-1流變儀測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.67%明膠溶液的膠凝溫度和熔化溫度。設(shè)定溫度變化速率為1 ℃/min，應(yīng)變1%，測試夾具40 mm Al平板，Peltier溫度控制系統(tǒng)，板間距為0.5 mm，溫度掃描由40 ℃冷卻到5 ℃，在5 ℃保持10 min，然后由5 ℃加熱到40 ℃，記錄儲能模量G’和損耗模量G”隨溫度掃描的變化曲線。

1.3.4 明膠的氨基酸組成分析

參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測定》中的方法測定羥脯氨酸含量，用全自動氨基酸分析儀測定其他氨基酸組成及含量，具體分析方法：稱取20 mg樣品于18 mm×180 mm試管中，加入5 mL 6 mol/L鹽酸，振蕩混勻。用酒精噴燈把該試管口下1/3處拉細(xì)到4～6 mm，抽真空后封管。處理過的試管置（110±1）℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，拿出冷卻至室溫，搖勻過濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，60 ℃恒溫水浴蒸干濾液，加入0.02 mol/L鹽酸稀釋3 倍，用0.22 μm濾膜過濾上機(jī)。一個樣品分析周期53 min。分析儀采用2 個泵和2 根柱。即洗脫液經(jīng)泵1流過分離柱，泵壓12.260 MPa，流速0.45 mL/min，柱溫70 ℃；茚三酮經(jīng)泵2流過反應(yīng)柱，泵壓0.780 MPa，流速0.35 mL/min，反應(yīng)柱（4.6 mm×60 mm）柱溫135 ℃。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

采用SDS-PAGE分析明膠的亞基組成和分子質(zhì)量分布。SDS-PAGE條件：質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的分離膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠；10×Tris-Gly緩沖液（含0.25 mol/L Tris、1.92 mol/L Gly、10 g/L SDS，稀釋10 倍作內(nèi)槽電泳液）；5×樣品緩沖液（含250 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.1 g/mL SDS、5 mg/mL BPB、體積分?jǐn)?shù)50%甘油、體積分?jǐn)?shù)5% β-巰基乙醇）；考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（含1 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250、體積分?jǐn)?shù)25%異丙醇、體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸）；考馬斯亮藍(lán)脫色液（含體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸、體積分?jǐn)?shù)0.05%乙醇）。配制1 mg/mL的明膠溶液，按體積比4∶1添加5×樣品緩沖液，沸水浴5 min，冷卻后上樣，上樣量為15 μL（Marker上樣量為10 μL）。15 mA恒流電泳，待溴酚藍(lán)跑到分離膠中后，電流調(diào)至25 mA，電泳時間約1.5 h?？捡R斯亮藍(lán)染色2 h后用脫色液脫色，多次更換脫色液直至背景脫凈，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜，用Gene Tools（Syngene，Cambridge，UK）軟件分析圖譜。

1.3.6 紫外光譜掃描

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的明膠溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)用紫外分光光度計進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，以去離子水為空白對照。

1.3.7 紅外光譜掃描

1 mg干明膠加100 mg KBr混合均勻，研成粉末，烘干后壓片，用紅外光譜儀掃描400～4 000 cm－1的吸收光譜，掃描次數(shù)32 次，分辨率4 cm－1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度

本實(shí)驗(yàn)制備的金槍魚皮明膠凝膠強(qiáng)度為403 g，稍低于豬皮明膠（426 g）。影響明膠凝膠強(qiáng)度的因素有明膠的氨基酸組成和分子質(zhì)量分布。明膠中亞氨基酸含量越高，亞基組分含量越高，明膠的凝膠強(qiáng)度越高。通常情況下，水產(chǎn)明膠的亞氨基酸含量低于哺乳動物明膠，故凝膠強(qiáng)度與之相比也稍低[16-17]。本實(shí)驗(yàn)制備的金槍魚皮明膠與豬皮明膠的凝膠強(qiáng)度相近，高于一些報道的水產(chǎn)明膠[18]（如尼羅羅非魚皮明膠凝膠強(qiáng)度為328 g[19]，三文魚皮明膠凝膠強(qiáng)度為108 g，鱈魚皮明膠凝膠強(qiáng)度為71 g[20]），可能是由于屬于溫水魚的金槍魚皮明膠中亞氨基酸含量與哺乳動物明膠較為接近，因而其凝膠強(qiáng)度與哺乳動物明膠相差不大。

2.2 膠凝溫度和熔化溫度

使用DHR-1流變儀測定金槍魚皮明膠和豬皮明膠的膠凝溫度和熔化溫度，溫度掃描分為3 個階段：降溫、恒溫和升溫過程。明膠具有一定的黏彈性，儲能模量（G’）和損耗模量（G”）分別代表它的彈性部分和黏性部分，通常情況下，用降溫和升溫過程中儲能模量和損耗模量的交點(diǎn)代表明膠的膠凝溫度和熔化溫度。

由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)制備的金槍魚皮明膠的膠凝溫度和熔化溫度分別為21.5 ℃和28.8 ℃，低于豬皮明膠的膠凝溫度和熔化溫度（25.3 ℃和33.4 ℃）。與凝膠強(qiáng)度類似，明膠的膠凝溫度和熔化溫度同樣與明膠亞氨基酸含量與分子質(zhì)量有關(guān)[10]，故大目金槍魚皮明膠膠凝溫度和熔化溫度也較低。與凝膠強(qiáng)度相同，但與熔點(diǎn)更高的豬皮明膠相比，此類明膠更適合在甜品制作中使用，因?yàn)槠浼炔粫驗(yàn)槿刍瘻囟冗^低而在儲運(yùn)過程中熔化，也可在食用時更有助于釋放水果軟糖中水果的香氣[11]。

圖1 金槍魚皮明膠與豬皮明膠的膠凝溫度和熔化溫度Fig. 1 Gelling points and melting points of tuna skin gelatin and pork skin gelatin

2.3 氨基酸組成分析

表1 金槍魚皮明膠與豬皮明膠的氨基酸組成Table 1 Amino acid compositions of tuna skin and pork skin gelatins

由表1可知，本實(shí)驗(yàn)制備的金槍魚皮明膠與豬皮明膠有著相似的氨基酸組成。金槍魚皮明膠中，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.09%，低于豬皮明膠中的亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（22.82%）。與豬皮明膠相比，金槍魚皮明膠中，絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和蛋氨酸含量明顯偏高，而組氨酸含量偏低，與一些水產(chǎn)明膠氨基酸組成方面研究[23-24]一致。

明膠中亞氨基酸的含量越高，明膠的凝膠特性和流變學(xué)性能越好，這也是大目金槍魚皮凝膠特性和流變學(xué)特性低于豬皮明膠的主要原因。研究表明冷水魚類明膠中亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在17%左右[12]，由此可見大目金槍魚皮明膠的凝膠特性和流變學(xué)性能可能優(yōu)于已報道的大部分冷水魚皮明膠。

2.4 SDS-PAGE分析結(jié)果

明膠是膠原蛋白經(jīng)酸、堿或酶處理后熱提取形成的高聚物，熱提取過程中，維系膠原蛋白分子間的共價交聯(lián)以及肽鍵會產(chǎn)生隨機(jī)性斷裂，故水解過后的明膠分子中，除α、β、γ等亞基組分外，還存在一些小分子組分。小分子組分含量越高，明膠凝膠特性就越差[25-27]。

圖2 金槍魚皮明膠與豬皮明膠SDS-PADE圖譜Fig. 2 SDS-PADE profiles of tuna skin and pork skin gelatins

由圖2可以看出，2 種明膠的分子質(zhì)量分布都非常相似，都主要由100～120 kDa的α1和α2帶、大于200 kDa的β帶、及更高分子質(zhì)量的γ帶組成。經(jīng)Gene Tools軟件分析可以得到豬皮明膠樣品中分子質(zhì)量低于100 kDa的小分子組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.4%，而金槍魚皮明膠中小分子組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)更低，為6.67%，這可能也是屬于水產(chǎn)明膠的金槍魚皮明膠凝膠強(qiáng)度與豬皮明膠凝膠強(qiáng)度接近的原因之一。

2.5 紫外光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，這些氨基酸由于共軛雙鍵的存在，在紫外波長范圍為280 nm左右有明顯的吸收峰。但明膠中的芳香族氨基酸含量較少，使其在280 nm波長處的吸收峰不明顯[28]。明膠中由于存在C＝O、CONH2、—COOH等發(fā)色基團(tuán)，紫外特征吸收峰通常出現(xiàn)在220 nm波長左右[29]。由圖3可知，金槍魚皮明膠、豬皮明膠的吸收峰分別出現(xiàn)在206 nm和208 nm波長處，與陳小雷[30]的結(jié)果相一致。2 種明膠在280 nm波長處都無明顯的吸收峰，說明2 種明膠中的芳香族氨基酸含量都很少。這與氨基酸組分分析相一致。

圖3 金槍魚皮明膠與豬皮明膠的紫外吸收光譜Fig. 3 UV absorption spectra of tuna skin and pork skin gelatins

2.6 紅外光譜分析結(jié)果

圖4 金槍魚皮明膠（a）與豬皮明膠（b）的紅外光譜Fig. 4 Infrared spectra of tuna skin (a) and pork skin gelatins (b)

從圖4可以看出，金槍魚皮明膠與豬皮明膠各峰形一致，均具有膠原蛋白的特征振動模式。金槍魚皮明膠和豬皮明膠的酰胺A帶分別出現(xiàn)在3 434.65 cm－1和3 406.68 cm－1，是N—H伸縮振動或O—H伸縮振動的吸收峰。當(dāng)肽鍵中的N—H基團(tuán)參與氫鍵的形成時，酰胺A帶常向低波數(shù)移動[21]，說明在金槍魚皮明膠中與N—H相關(guān)的氫鍵含量略低于豬皮明膠。金槍魚皮明膠和豬皮明膠的酰胺I帶分別出現(xiàn)在1 648.02 cm－1和1 659.28 cm－1，代表了C＝O的伸縮振動，與豬皮明膠相比，金槍魚皮明膠的酰胺I帶發(fā)生了紅移，說明在金槍魚皮明膠中與羰基有關(guān)的氫鍵含量與豬皮明膠相比略高。酰胺II帶分別出現(xiàn)在1 547.47 cm－1和1 540.36 cm－1處，表示C—N伸縮或N—H彎曲振動。酰胺III帶是C—H振動的吸收峰，這部分結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的三級螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。膠原蛋白水解成明膠的過程即是膠原三螺旋結(jié)構(gòu)解旋并逐漸水解的過程，金槍魚皮明膠和豬皮明膠分別在1 243.57 cm－1和1 240.77 cm－1處出現(xiàn)酰胺III帶的吸收峰，說明在制備明膠時，三螺旋結(jié)構(gòu)遭到部分破壞但仍有保留。從峰面積看，豬皮明膠三螺旋破壞更徹底[27]，可能制備豬皮明膠的條件更劇烈，因而產(chǎn)生的小分子也較多，這與電泳結(jié)果相一致。此外，金槍魚皮明膠中還有一部分其他的吸收峰，如2 924.79 cm－1的C—H伸縮振動的吸收峰，1 453.83 cm－1的—CH—、—CH3的彎曲振動的吸收峰，1 384 cm－1的—CH2—搖擺振動吸收峰，1168.42 cm－1的C—N—C振動或C—O伸縮振動的吸收峰，這些吸收峰的存在說明明膠分子屬于順式構(gòu)型。多肽鍵大部分肽鏈中的肽單位都是反式構(gòu)型，只有脯氨酸和羥脯氨酸的殘基肽單位是順式構(gòu)型[31]，金槍魚皮明膠中的脯氨酸和羥脯氨酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)19%，這進(jìn)一步說明實(shí)驗(yàn)所制得的產(chǎn)物為高純度明膠。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)先用堿再用酸處理魚皮，隨后熱水提取制備金槍魚皮明膠，研究所得明膠的一些理化性質(zhì)，并與豬皮明膠進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，所得魚皮明膠的凝膠強(qiáng)度（403 g）、膠凝溫度（21.5 ℃）和熔化溫度（28.8 ℃）均低于豬皮明膠。與哺乳動物明膠相比，水產(chǎn)明膠中亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較低，故膠凝溫度和熔化溫度較低。氨基酸組成分析剛好說明了這一點(diǎn)，金槍魚皮明膠亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.09%，低于豬皮明膠（22.82%）。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，金槍魚皮明膠中的亞基組分保存較完整，高分子質(zhì)量組分含量與豬皮明膠含量相當(dāng)。金槍魚皮明膠的紫外吸收光譜與紅外吸收圖譜與豬皮明膠相似，都具有膠原蛋白的特征振動模式，且紫外吸收光譜顯示2 種明膠的芳香族含量較少，紅外圖譜中顯示2 種明膠中亞氨基酸的存在，與氨基酸組分分析相對應(yīng)。以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)制備的金槍魚皮明膠與豬皮明膠的性質(zhì)相當(dāng)，且優(yōu)于大部分水產(chǎn)明膠，又可避免疾病與宗教因素的限制，可以考慮將其作為哺乳動物明膠替代品使用，為合理利用金槍魚副產(chǎn)物及尋找更好的明膠替代品提供了理論依據(jù)。

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