姚曉琳，陳 玉，舒 蒙，張 琨，姜發(fā)堂

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖北 武漢 430030；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；3.福格森（武漢）生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430056）

蛋白質(zhì)和多糖是食品中最常用的乳化劑，是影響乳液物理化學(xué)穩(wěn)定性的重要因素之一。在水包油型乳液中，蛋白質(zhì)可在油滴表面吸附形成具有一定黏彈性的界面膜，防止由乳滴聚集或絮凝導(dǎo)致的乳液分層。多糖可增加連續(xù)相的黏度，通過(guò)阻礙乳滴的運(yùn)動(dòng)提高乳液穩(wěn)定性[1-2]。多糖和蛋白質(zhì)相互作用以賦形和提高穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用到食品科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)中，形成的非共價(jià)靜電復(fù)合物具有重要的生物學(xué)意義，且易于在產(chǎn)品配方中使用，引起了學(xué)術(shù)界的廣大關(guān)注[3]。利用明膠和果膠間的靜電作用，制備與低熱量淀粉顆粒類(lèi)似尺寸和功能性的水凝膠顆粒[4]。在益生菌微囊包封技術(shù)中，利用多糖-蛋白復(fù)合物可改善在不同應(yīng)力下的益生菌活性[5]。利用大豆分離蛋白-海藻酸鈉共聚物制備番茄紅素膠束，解決了番茄紅素溶解性及穩(wěn)定性差等問(wèn)題[6]。多糖-蛋白復(fù)合物兼具蛋白質(zhì)優(yōu)越的乳化活性和多糖的空間穩(wěn)定性，有效提高食品乳液的穩(wěn)定性[7-8]。

靜電力是蛋白質(zhì)和多糖相互作用的最主要推動(dòng)力。在pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷，可與陰離子多糖形成復(fù)合物。研究表明，蛋白質(zhì)與多糖在靜電作用下結(jié)合，使蛋白質(zhì)界面層得到保護(hù)；多糖的高分子質(zhì)量和高親水性，使乳滴之間存在空間斥力，防止乳滴的聚結(jié)[1]。蛋白質(zhì)和多糖的相互作用受到許多因素的影響，如pH值、離子強(qiáng)度、混合比例等。隨著蛋白與多糖混合比例的不同，可形成可溶性分子內(nèi)復(fù)合物、可溶性分子間復(fù)合物、不溶性分子間復(fù)合物等[9-11]。前期研究表明，阿拉伯膠（gum arabic，GA）和乳清分離蛋白（whey protein isolation，WPI）以質(zhì)量比2∶1混和，pH 4.4時(shí)可形成穩(wěn)定的可溶性分子內(nèi)復(fù)合物，具有非常優(yōu)越的乳化活性和乳液穩(wěn)定性[12]。但WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物對(duì)pH值敏感，當(dāng)乳液體系偏離pH 4.4時(shí)便會(huì)發(fā)生解離，從而引起乳液穩(wěn)定性下降。

本實(shí)驗(yàn)中以WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物為乳化劑，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）微球，通過(guò)評(píng)價(jià)CLA微球的穩(wěn)定性及其胃腸消化釋放特性，旨在提高WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的pH值穩(wěn)定性，為擴(kuò)大WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GA 日本San-Ei Gen食品公司；WPI 美國(guó)戴維斯柯公司；CLA（純度80%） 北京豪爾斯科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；NaCl、CaCl2、膽鹽3號(hào) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastersizer 2000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；PT-MR2100高速剪切預(yù)乳化機(jī) 瑞士Kinematica公司；ORION 4 STAR pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡儀器設(shè)備有限公司；雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 CLA微球的制備

GA和WPI按質(zhì)量比2∶1，稱(chēng)取適量的WPI和GA溶于純水之中，置于滾軸混合器上室溫混合12 h，使其充分溶解混勻，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為4.4，攪拌1 h，形成穩(wěn)定的WPI-GA可溶性分子內(nèi)復(fù)合物。取適量CLA于無(wú)水乙醇中，制備100 mg/mL的CLA-乙醇溶液，攪拌1 h。將CLA-乙醇溶液緩慢逐滴加入高速剪切攪拌（20 000 r/min）的WPI-GA溶液中。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，快速除去乙醇，即得CLA微球分散液，CLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，按照上述方法，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.5%、1%、2%和5%的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物。將新鮮制備的樣品進(jìn)行冷凍干燥，可得到粉末狀CLA微球。

1.3.2 CLA微球粒徑的測(cè)定

將乳液輕微振蕩搖勻，逐滴加至超純水分散劑中，通過(guò)Hydro 2000MU型濕法進(jìn)樣器進(jìn)樣。分散相和連續(xù)相的折光率分別為1.52和1.33，樣品的吸收率為0.01，泵速為2 000 r/min。添加樣品至激光指數(shù)略大于10%，即可開(kāi)始測(cè)定。乳液的平均粒徑用表面積加權(quán)平均值D[3,2]表示，按公式（1）計(jì)算：

式中：ni表示粒徑大小為di的顆粒數(shù)目。

1.3.3 CLA微球物理穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)

將制備得到的新鮮CLA微球分散液置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，放置0、3、5、7 d后進(jìn)行乳液粒徑測(cè)定。

1.3.4 CLA微球微觀(guān)形貌的觀(guān)察

取極少量CLA微球粉末于掃描電鏡樣品臺(tái)上，噴金，置于掃描電鏡下觀(guān)察，拍照記錄。

1.3.5 CLA微球包封率的測(cè)定

采用正己烷配制一定質(zhì)量濃度CLA溶液，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，測(cè)定CLA的最大吸收波長(zhǎng)為234 nm。在最大吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定不同質(zhì)量濃度CLA溶液（0～10 μg/mL）的吸光度，繪制吸光度與CLA質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到相關(guān)性方程為y=0.097 5x－0.010 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2，線(xiàn)性關(guān)系良好。

取1 mL CLA微球分散液乳液，加入10 mL正己烷，充分振蕩萃取，離心取正己烷相，在234 nm波長(zhǎng)下測(cè)定CLA的吸光度。根據(jù)CLA在正己烷中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，按公式（2）計(jì)算CLA包封率[13]：

1.3.6 CLA微球在模擬胃腸環(huán)境下釋放率的測(cè)定

取1.0 mL CLA微球混懸液置于37 ℃預(yù)溫的29.0 mL模擬胃液（2 mg/mL NaCl、3.2 mg/mL胃蛋白酶、HCl溶液調(diào)pH值至2.0）中，37 ℃恒溫水浴，攪拌速率為100 r/min，消化3 h，期間每30 min調(diào)一次pH值使其穩(wěn)定于2.0，分別于30、60、90、120、150、180 min取樣品測(cè)定CLA的釋放率。取1.0 mL用于測(cè)定粒徑，1.0 mL加等量正己烷萃取，并定容至10.0 mL，測(cè)定234 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并計(jì)算含量。

胃消化階段結(jié)束后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，轉(zhuǎn)移至30 mL模擬腸液（8 mg/mL NaCl，40 mg/mL CaCl2，5 mg/mL膽鹽，10 mg/mL胰蛋白酶）中，繼續(xù)37 ℃恒溫水浴，攪拌速率為100 r/min，消化3 h，期間每30 min調(diào)一次pH值使其穩(wěn)定于7.0，分別于30、60、90、120、150、180 min取樣品測(cè)定CLA的釋放率。取1.0 mL用于測(cè)定粒徑，1.0 mL加等量正己烷萃取，并定容至10.0 mL，測(cè)定234 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并計(jì)算含量[6,14]。按公式（3）計(jì)算CLA釋放率：

2 結(jié)果與分析

2.1 WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)CLA微球粒徑的影響

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球平均粒徑（A）和分布（B）Fig. 1 Mean particle size of D[3,2] (A) and distribution (B) of CLA microspheres stabilized with different concentrations of WPI-GA intramolecular complex

以WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物為乳化劑，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備CLA微球，由圖1可知，隨著WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，新鮮CLA微球平均粒徑呈現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的粒徑較大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～2%制備的CLA微球粒徑分布接近，平均粒徑趨于恒定，意味著WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物在CLA微球界面吸附已達(dá)到飽和[15]。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大到5%時(shí)，平均粒徑呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，CLA微球發(fā)生輕微絮凝。這是由于水相中游離的過(guò)量乳化劑會(huì)導(dǎo)致由排空效應(yīng)造成的微球絮凝[16-18]。由圖1B可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的CLA微球粒徑均呈現(xiàn)單峰分布，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%的CLA微球粒徑較小。表明該質(zhì)量分?jǐn)?shù)的由乳化-溶劑揮發(fā)法制備CLA微球分布均一、穩(wěn)定性較好。

2.2 CLA微球的物理穩(wěn)定性

由不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的GLA微球40 ℃貯存條件下的粒徑變化見(jiàn)圖2，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的CLA微球在7 d貯存期內(nèi)粒徑分布無(wú)明顯變化，5% WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)少量的顆粒絮凝，表明CLA微球具有較好的物理穩(wěn)定性。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球的貯存穩(wěn)定性Fig. 2 Mean particle size distribution of CLA microspheres stabilized with different concentrations of WPI-GA intramolecular complex during 7 d storage

2.3 CLA微球的微觀(guān)形貌和復(fù)溶特性

圖3 2%WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球的微觀(guān)形貌Fig. 3 Micrograph of CLA microspheres stabilized with 2% WPI-GA intramolecular complex

由圖3可知，乳化-溶劑揮發(fā)法制備的CLA微球，分布較均勻，顆粒表面皺褶塌陷，具有較厚的界面層。這是由于乳化后進(jìn)行的溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致包裹在CLA微球內(nèi)部的乙醇逸去，使乳化形成的圓形顆粒發(fā)生塌陷和界面皺縮[19]。由于WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物在pH值4.4時(shí)形成，當(dāng)pH值偏離4.4時(shí)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物會(huì)發(fā)生解離、或由凝聚導(dǎo)致生成沉淀。本實(shí)驗(yàn)選用乳化-溶劑揮發(fā)法制備CLA微球，利用溶劑的揮發(fā)從而使CLA乳滴界面發(fā)生皺縮和聚集，以提高乳滴界面吸附的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的穩(wěn)定性。

圖4 WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球凍干性狀（A）及復(fù)溶特性（B）Fig. 4 Freeze drying (A) and re-dissolution (B) properties of CLA microspheres stabilized with WPI-GA intramolecular complex

由圖4A可知，當(dāng)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，制備的CLA微球基本無(wú)法凍干，出油嚴(yán)重，WPI-GA在界面無(wú)法完全包覆CLA液滴，導(dǎo)致凍干過(guò)程中CLA大量溢出。當(dāng)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，CLA微球凍干后出現(xiàn)明顯聚結(jié)而形成塊狀；當(dāng)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至1%以上，CLA微球凍干后呈現(xiàn)粉末狀，以5% WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球粉末狀最為細(xì)膩，貯存分散性最好。將凍干后的CLA微球粉末溶解還原至新鮮制備的分散液濃度，進(jìn)行粒徑分析，由圖4B可知，1% WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球粉末復(fù)溶后出現(xiàn)部分顆粒聚集，粒徑變大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%和5%的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球粉末復(fù)溶后的粒徑分布與新鮮制備的相接近，CLA微球粉末復(fù)溶效果較好。

2.4 CLA微球的包封率

表1 WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球的包封率Table 1 Encapsulation efficiency of CLA microspheres stabilized with different concentrations of WPI-GA intramolecular complex

從表1可以看出，當(dāng)CLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)CLA微球的包封率逐漸升高。當(dāng)WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到2%時(shí)，包封率達(dá)到97%以上，包封效果良好。本實(shí)驗(yàn)選用乳化-溶劑揮發(fā)法制備CLA微球，利用溶劑的揮發(fā)使CLA乳滴界面發(fā)生皺縮和聚集，提高了乳滴界面吸附的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的穩(wěn)定性，使CLA微球界面厚度增加，可有效防止CLA的溢出與氧化。

2.5 CLA微球在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性和釋放率

由圖5可知，乳化-溶劑揮發(fā)法制備的CLA微球，由于WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物在界面的聚集，提高了復(fù)合物的pH值穩(wěn)定性。CLA微球在模擬胃液中較為穩(wěn)定，基本保持單峰分布，隨著在模擬胃液中時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)大顆粒聚集峰，CLA的釋放率緩慢增加。推測(cè)是由于CLA微球界面上的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物在胃蛋白酶的作用下開(kāi)始逐漸被酶解，導(dǎo)致CLA微球的界面保護(hù)屏障降低[20-21]。因此CLA向體系擴(kuò)散的速率逐漸增大，在胃液180 min時(shí)釋放率達(dá)到36.0%。在模擬腸液中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CLA微球的大顆粒聚集峰增加明顯，CLA釋放率也呈現(xiàn)迅速增大的趨勢(shì)，在180 min時(shí)CLA釋放率達(dá)到約62.2%。與模擬胃液相比，CLA在模擬腸液中的釋放速率較快。這是由于CLA微球在模擬腸液中出現(xiàn)明顯的大顆粒聚集，推測(cè)是小腸內(nèi)的膽鹽取代了微球界面的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物[22-28]，加速了胰蛋白酶在界面的吸附和微球界面保護(hù)屏障的破壞，相對(duì)更易出現(xiàn)微球間的聚集[29-30]，導(dǎo)致CLA釋放率顯著增大。

圖5 2%WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物制備的CLA微球在模擬胃腸環(huán)境中的粒徑變化（A）和CLA釋放率（B）Fig. 5 Particle size distribution (A) and release kinetics (B) of CLA microspheres stabilized with 2% WPI-GA intramolecular complex in simulated gastrointestinal juice

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物為乳化劑，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備CLA顆粒，利用溶劑揮發(fā)使CLA微球界面上的WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物發(fā)生界面聚集，CLA微球界面出現(xiàn)塌陷皺縮，提高了WPI-GA分子內(nèi)復(fù)合物的pH

值穩(wěn)定性，使其具備良好的CLA胃腸輸送特性，提高了多糖-蛋白質(zhì)靜電復(fù)合物的應(yīng)用價(jià)值。

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