劉昌明，鄧良超，孫玉錦

糖尿病腎病(diatetes nephritic，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，也是慢性腎功能衰竭的的主要病因。隨著糖尿病發(fā)病率不斷上升，DN的發(fā)病也逐年增加。褪黑素(melatonin，Mel)化學(xué)名是N-乙酰-5-甲氧基色胺，是松果體分泌的一種吲哚類激素，全身各組織器官內(nèi)均有Mel存在，在調(diào)節(jié)睡眠，抵抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞看、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)血糖等方面具有廣泛的生理和藥理作用[1-2]。

本研究采用大鼠DN模型，探討褪黑素對(duì)大鼠DN腎臟影響極其機(jī)制，為褪黑素對(duì)DN防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 鏈脲佐菌素、褪黑素購(gòu)自Sigma公司；肌酐(Cr)測(cè)試盒，血尿素氮(BUN)測(cè)試盒，尿蛋白測(cè)試盒(定量測(cè)試盒)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒，丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(POD)DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、BeyoECL Plus、顯影定影試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均來自碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體epitomics公司，PVDF膜購(gòu)自Roche公司，瓊脂糖來自西班牙，脫脂奶粉超市購(gòu)買。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的復(fù)制 體重160±10g的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，禁食不禁水12h，隨機(jī)分為正常對(duì)照(NC)組、糖尿病腎病組(DN)，褪黑素(Mel)組各8只，DN組、(Mel)組給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30mg/kg(STZ溶解于pH4.4，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液中)，NC組注射相同體積檸檬酸緩沖液。禁食不禁水6 h后。DN組、Mel組每天分別給予褪黑素20mg/kg/d灌胃(Mel溶于無水乙醇中，再生理鹽水稀釋，使之成為含有2%乙醇的生理鹽水溶液)和給予高脂飼料，NC組給予等量含有2%乙醇的生理鹽水溶液灌胃、給予普通飼料。連續(xù)給藥6周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集6周后各組大鼠禁食不禁水12小時(shí)，收集24小時(shí)尿液,斷尾取血，用血糖儀檢測(cè)FBG。3%戊巴比妥鈉2mL/kg麻醉心臟穿刺取血備用，取雙腎，一側(cè)腎臟部分用4%中性甲醛固定，制作石蠟切片，用于觀察腎臟的組織結(jié)構(gòu)，另一部分制備1%的組織勻漿檢測(cè)腎組織氧化應(yīng)激水平，另一側(cè)腎臟放于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 石蠟切片的處理石蠟切片常規(guī)HE染色；Masson染色：切片脫蠟至水，Masson復(fù)合液染色5min，依次用0.2%醋酸、5%磷鎢酸、0.2%醋酸、2%苯胺藍(lán)、0.2%醋酸、無水乙醇沖洗，脫水，透明樹膠封片；TUNEL染色：采用原位末端標(biāo)記法，按照試劑盒說明說進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。

1.2.4 腎臟氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)取腎組織勻漿按照試劑盒說明書檢測(cè)腎組織內(nèi)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。

1.2.5 腎功能的檢測(cè)按照試劑盒說明書Fearon法檢測(cè)BUN；Jaffe除蛋白法檢測(cè)Scr；采用CBB法檢測(cè)24hUP。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)腎組織Caspase-3蛋白測(cè)定采用Western blot法。腎組織經(jīng)過勻漿—裂解—離心—蛋白定量—充分變性，-40℃保存。

按SDS-PAGE凝膠配置試劑盒說明書配制出12%分離膠，灌注到兩塊玻璃板的間隙中，注入ddH2O液封。在分離膠完全聚合后，傾倒出ddH2O，配制5%的濃縮膠搖勻靜置直接灌滿，并立即插入梳子。將凝膠玻璃板固定于電泳槽內(nèi)，向槽內(nèi)加入電泳緩沖液。然后加樣、用100V恒壓電泳約30min、剪出與膠大小一致的PVDF膜，用甲醇濕潤(rùn)，和膠、轉(zhuǎn)膜濾紙、海綿一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜，390mA恒流轉(zhuǎn)膜50min。將轉(zhuǎn)膜后PVDF膜TBS漂洗，用含5%脫脂奶粉的TBST4℃封閉過夜，進(jìn)過孵一抗(caspase-3一抗)、孵內(nèi)參(Rabbit anti-β-actin)、孵二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG)、ECL化學(xué)發(fā)光、壓片、顯影、定影。結(jié)果用Quantity one軟件分析各組蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況與血糖的改變 NC組，體重增加，精神好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)鮮艷有光澤；DN組精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，皮毛無光澤，多飲、多食、多尿癥狀明顯，與NC組相比FBG較顯著升高；Mel組大鼠精神稍好，毛發(fā)有光澤，反應(yīng)較靈敏，與DN組相比FBG較下降不明顯(見表2)。

2.2 病理學(xué)改變HE染色顯示NC組大鼠腎小球和腎小管無明顯病理改變；Masson染色腎臟未見明顯纖維組織增生(圖1)；TUNEL染色細(xì)胞凋亡少或無(圖4)；DN組HE染色可見變腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞水腫，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞增生顯著；Masson染色見基底膜增厚，系膜增寬，腎小球纖維化，部分腎小管萎縮甚至消失，間質(zhì)纖維組織增生(圖2)；TUNEL染色凋亡細(xì)胞較DN組和Mel組明顯增多(圖5)。Mel組與DN組相比腎小管水腫較明顯減輕，纖維化有明顯的改善，凋亡細(xì)胞也明顯減少(圖3、6)。

圖1 NC組腎組織結(jié)構(gòu)

圖2 DN組腎組織結(jié)構(gòu)

圖3 Mel組腎組織結(jié)構(gòu)

圖4 NC組腎組織結(jié)構(gòu)

圖5 DN組腎組織結(jié)構(gòu)

圖6 Mel組腎組織結(jié)構(gòu)

圖7 各組織caspase-3的表達(dá)(相對(duì)灰度)

2.3 血糖、腎功能的變化 與NC組相比：DN組Scr 、BUN、24hUP明顯升高(P<0.05)。與DN組相比：Mel組Scr 、BUN、24hUP均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組FBG、BUN、Scr 、24h尿蛋白(UP)的變化(±s)n=8

2.4腎組織氧化指標(biāo)變化 與NC組相比：DN組腎組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與DN組相比：Mel組腎組織SOD、GSH-Px活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯下降(P<0.05)。見表2。

表2 各組腎組織SOD、GSH-Px、MDA的變化(±s)n=8

2.5Caspase-3蛋白和AI的變化 與DN組相比,Mel組腎臟細(xì)胞AI明顯降低(P<0.05)caspase-3蛋白的表達(dá)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與NC組相比：DN組腎臟細(xì)胞AI、caspase-3蛋白的表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)(圖7)

表3 各組AI、caspase-3蛋白的變化(±s)n=8

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用一次性腹腔內(nèi)注射STZ30mg/kg加高脂飲食復(fù)制大鼠DN模型，實(shí)驗(yàn)6周后，DN組大鼠出現(xiàn)了腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞水腫，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚，系膜增寬，腎小球纖維化，部分腎小管萎縮甚至消失，間質(zhì)纖維組織增生等明顯的腎組織結(jié)構(gòu)損害，說明DN模型復(fù)制成功[1～2]。

DN是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的重要的原因。近年來對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的研究中，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡成為研究其發(fā)病機(jī)制的重要的環(huán)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[3]，使用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)氧化應(yīng)激水平升高和腎功能損害，因此血糖升高可能是DN發(fā)生的關(guān)鍵因素。在糖尿病腎病患者存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。持續(xù)的高血糖可導(dǎo)致SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性降低，使腎臟的抗氧化能力下降，MDA可以反應(yīng)機(jī)體的過氧化強(qiáng)度，其含量升高使機(jī)體氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),ROS的大量增加，加重了腎臟的負(fù)擔(dān)，促進(jìn)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。由于大量ROS的產(chǎn)生，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，可導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷使腎小球?yàn)V過膜電荷屏障和孔徑發(fā)生改變，腎小球?yàn)V過率增加，引起蛋白尿的發(fā)生[7]。ROS可使腎小球毛細(xì)血管基底膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使其增厚；通過MAPK途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，參與腎間質(zhì)纖維化形成。氧化應(yīng)激水平的增強(qiáng)，可使增強(qiáng)的單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附和浸潤(rùn)，使腎小球系膜細(xì)胞增生、增加了血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性[8]。長(zhǎng)期的高血糖還可以增強(qiáng)機(jī)體蛋白糖基化反應(yīng)，降低機(jī)體的抗氧化能力，使腎組織產(chǎn)生大量的MDA，過多的MDA與含有游離氨基酸的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血管基底膜增厚，使腎組織血管壁通透性增加，加重腎臟的損傷，導(dǎo)致腎小球高濾過和大量蛋白尿[9-10]。

徐益笑等[11]通過對(duì)穩(wěn)定高血糖大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可使腎組織內(nèi)促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)增多，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)減少，腎小管上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞明顯增多，認(rèn)為高糖狀態(tài)可能改變了凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖導(dǎo)致腎功能受損。在大鼠糖尿病模型建立4周后就可出現(xiàn)腎臟明顯的細(xì)胞凋亡[12],表明在DN早期腎組織就出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡，因此在持續(xù)的高血糖作用下，腎組織細(xì)胞凋亡增多，增殖細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致腎功能障礙的發(fā)生。caspase家族在細(xì)胞凋亡的發(fā)生過程中具有重要作用，其中caspase-3蛋白使細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。此外，ROS的增多也與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，增多的ROS作為早期凋亡信號(hào)分子，直接激活促凋亡的p38MAPK和caspase-3途徑，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。ROS也可直接損傷DNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者攻擊蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)的功能喪失，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

本實(shí)驗(yàn)表明，DN組大鼠FBG和Scr、BUN、24hUP明顯升高，腎組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量明顯升高，caspase-3蛋白的表達(dá)量以及AI顯著升高，說明糖尿病大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的損傷，氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增多。

給予外源性的Mel后，除DN大鼠的血糖具有一定程度降低外，Mel可顯著降低大鼠DN時(shí)的BUN等指標(biāo)，具有明顯的改善腎功能作用；顯著升高SOD活性和降低MDA含量，顯著降低caspase-3蛋白的表達(dá)量以及AI，SOD作為抗氧化酶，可特異性地清除氧自由基,其水平升高說明機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)。顯示褪黑素可能通過降低腎臟的氧化應(yīng)激水平，使ROS生成減少；Mel還能激活線粒體復(fù)合體，維持呼吸鏈電子傳遞，減少線粒體ROS的生成[13-14]。從而降低腎臟血管壁的通透性和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕對(duì)基底膜的損傷；抑制腎臟細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

綜上所述，褪黑素能夠明顯改善DN時(shí)的腎功能和減輕腎臟的損傷，抑制腎臟細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過一定程度的降糖作用，減少腎ROS的產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化酶的活性，減少細(xì)胞凋亡等實(shí)現(xiàn)的。

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