羅永鴻，黃永茂，林 雁，涂胡柳，鐘 利，陳 莊

據(jù)近年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測報告，大腸埃希菌是臨床分離的最常見病原體之一。整合子是一類具有位點特異性重組系統(tǒng)的可移動遺傳元件，定位于染色體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子中，攜帶耐藥基因使之在同種甚至不同種屬之間進行水平傳播[1]。據(jù)整合酶基因編碼氨基酸序列不同進行分類，其中較常見的是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子，整合子廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，其與細菌耐藥性密切相關(guān)[2]。本文通過檢測臨床分離的大腸埃希菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因，分析其與細菌耐藥性的關(guān)系，為臨床合理應(yīng)用抗生素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014年7月～2014年11月從西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院住院病例送檢標本中隨機抽樣獲得大腸埃希菌共147株(不含同一病例不同部位重復分離菌株)，所有菌株均經(jīng)全自動細菌鑒定儀VITEK系統(tǒng)確認為大腸埃希菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要試劑 藥敏紙片、M-H瓊脂、LB肉湯粉、細菌基因組DNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司)、2×TaqPCRMasterMix、4對引物(由上海生工生物公司合成)，引物序列[3]。見表1。

表1 靶基因引物序列及長度

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋、單人雙面無菌超凈工作臺、37℃恒溫培養(yǎng)箱、離心機、PCR反應(yīng)儀、凝膠DNA成像儀等。

1.4 藥敏實驗 在M-H瓊脂培養(yǎng)基上采用K-B法對臨床分離的147株大腸埃希菌進行藥敏試驗。藥敏紙片：CTX、CAZ、PIP、CIP、LEV、NA、NOR、GEN、AMK、SXT。結(jié)果判讀根據(jù)美國CLSI2016年指南分為三個類別:耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)。

1.5DNA提取 采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)，按說明書所提供步驟對臨床分離的147株大腸埃希菌進行基因組DNA的提取。

1.6 目的基因的檢測 將上述引物應(yīng)用PCR法進行目的基因的擴增。PCR反應(yīng)體系包括：模板DNA0.5μL、P1 1μL、P2 1μL、2×MasterMix10μL、ddH2O7.5μL,總反應(yīng)體系為20μL。PCR擴增產(chǎn)物熱循環(huán)參數(shù)均為:94℃預變性3min,然后94℃ 30s、58 ℃ 30s、72 ℃ 30s, 循環(huán) 32周期, 最后72℃延長5min。再挑選整合子陽性菌株在上述條件下進行可變區(qū)基因盒的擴增。所有產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，選取電泳條帶大小相同的各三個，送至上海生工生物公司進行測序。使用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)將所測序列與Genbank數(shù)據(jù)庫比對分析，確定整合子可變區(qū)內(nèi)所含的基因盒種類。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計學分析。

表2 147株大腸埃希菌藥物敏感實驗

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果

147株大腸埃希菌對11種臨床常見抗菌藥物敏感實驗結(jié)果見表2，其中鏈霉素、萘啶酸、復方新諾明、哌拉西林耐藥率高，分別占70.07%、82.31%、66.67%、68.03%；對丁胺卡那霉素耐藥率低，為3.40%。147株大腸埃希菌中有多耐藥菌株102株(69.39%)，其中耐藥模式以PIP+NOR+NA+SXT最常見，雙耐藥29株(19.73%)，單耐藥10株(6.80%)，全敏6株(4.08%)。

注：M為DNAmakerI，1為空白對照

圖1部分大腸埃希菌Ⅰ類整合酶基因擴增電泳圖

2.2 整合子檢測結(jié)果

臨床分離的147株大腸埃希菌中，攜帶Ⅰ類整合酶基因的菌株有98株，其中在多耐藥菌株中檢出84株，雙耐藥菌株中檢出12株，全敏菌株中檢出2株，單耐藥菌株中未檢出。部分大腸埃希菌Ⅰ類整合酶基因擴增電泳圖見圖1。Ⅰ類整合子陽性菌株與陰性菌株對11種抗菌藥物的耐藥率比較見表3。未檢測出Ⅱ、Ⅲ類整合子。

表3 大腸埃希菌Ⅰ類整合子陽性菌株與陰性菌株耐藥率

Ⅰ類整合酶基因在不同耐藥模式中檢出率比較見表4，兩兩比較提示：多耐模式與雙耐模式、多耐模式與單耐模式、雙耐模式與單耐模式、多耐模式與全敏模式，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 不同耐藥模式中Ⅰ類整合子檢出率比較

2.3 Ⅰ類整合子可變區(qū)檢測結(jié)果

98株攜帶Ⅰ類整合子的大腸埃希菌中有74株擴增出可變區(qū)基因盒，其中包含100-200bp(7株)、600-800bp(4株)、1200bp(63株)三種不同條帶，將上述條帶測序結(jié)果與Genbank已登錄的序列進行比對。100-200bp條帶經(jīng)測序比對為aac(6')-Ib-cr，與Genbank中登錄號為KY788352序列一致(同源性為98%)，編碼氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，賦予細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥；600-800bp條帶經(jīng)測序比對有dfrA5、dfrA7、aac(6')-Ib+cmlA1，dfrA5與Genbank中登錄號為HQ880248序列一致(同源性為99%)、dfrA7與Genbank中登錄號為EU250576序列一致(同源性為99%),編碼二氫葉酸還原酶，賦予細菌對甲氧芐啶耐藥，aac(6')-Ib+cmlA1與Genbank中登錄號為JN108884序列一致(同源性為100%)，編碼氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶+氯霉素外排泵，賦予細菌對氨基糖苷類+氯霉素抗菌藥物耐藥；1200bp條帶經(jīng)測序比對為dfrA17-aadA5，與Genbank中登錄號為DQ322597序列一致(同源性為99%)，編碼二氫葉酸還原酶+氨基糖苷類腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，賦予細菌對甲氧芐啶+氨基糖苷類抗菌藥物耐藥。

3 討 論

整合子作為可移動遺傳元件之一，在耐藥基因的獲取、表達、傳播中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的基因盒達數(shù)千種，其中大部分功能是未知的，目前已知的耐藥基因盒大約有130種，常見的耐藥基因有dfrA(甲氧芐啶)、aadA(鏈霉素)、qacE(季銨鹽化合物)[2]。整合子具有存儲、重排、表達基因盒的能力，在抗生素的選擇壓力下，細菌可以快速適應(yīng)環(huán)境。本研究中，臨床分離的102株多耐藥大腸埃希菌中檢測出Ⅰ類整合子陽性菌株84株，Ⅰ類整合子與多重耐藥之間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，且多耐模式分別與雙耐模式、單耐模式、全敏模式比較有顯著差異，表明攜帶Ⅰ類整合子的大腸埃希菌更容易表現(xiàn)為多耐藥模式。Singh，T等研究也表明Ⅰ類整合子與細菌的耐藥性密切相關(guān)[4]。在Ⅰ類整合子陽性菌株中存在2株對臨床常用抗菌藥物全部敏感，這可能與整合子缺乏相應(yīng)基因盒或整合子無法表達有關(guān)。

本研究中147株大腸埃希菌攜帶Ⅰ類整合酶基因的有98株(66.67%)，與黃永茂[5]對該院2007年7月～2008年7月臨床分離的71株大腸埃希菌攜帶Ⅰ類整合子情況(74.65%)相比有所下降，分析原因可能與近年來醫(yī)院對抗菌藥物的嚴格管控有關(guān)或本研究樣本量較前增大提高了數(shù)據(jù)的真實性。

Ⅰ類整合子陽性菌株對鏈霉素、慶大霉素、復方新諾明的耐藥率均高于陰性菌株(P<0.05)。這可能與整合子攜帶的耐藥基因盒有關(guān)。dfrA、aadA、aac(6')-Ib分別通過編碼二氫葉酸還原酶、氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，賦予對甲氧芐啶、鏈霉素、慶大霉素耐藥，同時整合子3'-保守區(qū)攜帶sul基因介導對磺胺類抗菌藥物耐藥[6]。然而，Ⅰ類整合子陽性的大腸埃希菌不僅對攜帶相應(yīng)基因盒的抗菌藥物敏感性降低，而且對其他抗菌藥物耐藥性提高，其中Ⅰ類整合子陽性菌株對頭孢他啶、頭孢噻肟、哌拉西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、諾氟沙星耐藥率均高于陰性菌株(P<0.05)，但未檢出相應(yīng)基因盒，上述現(xiàn)象表明可能有其他耐藥機制的存在。

本研究中147株大腸埃希菌中有98株攜帶Ⅰ類整合酶基因，其中有24株未擴增出可變區(qū)，這可能與有些整合子缺乏3'-保守區(qū)、沒有引物雜交位點、早期終止密碼子的存在等有關(guān)[7]。

細菌的耐藥問題成為全球公共衛(wèi)生問題之一，對抗菌藥物耐藥性的持續(xù)監(jiān)測為有效治療大腸埃希菌感染提供重要信息。多項研究表明Ⅰ類整合子與多重耐藥之間存在顯著相關(guān)性，因此整合子可作為多耐藥菌株全面可靠的分子標記[8]。

【參考文獻】

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