續(xù)夢玲,王一帆,何 花,郜發(fā)寶,郭玉林*

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院放射科，寧夏 銀川 750004；3.四川大學華西醫(yī)院放射科分子影像研究室,四川 成都 610041)

近年來，歐美地區(qū)結直腸癌新發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)居惡性腫瘤第3位[1-2]，在我國其發(fā)病率也呈上升趨勢。MR分子成像可實現(xiàn)細胞和分子層面的實時在體無創(chuàng)成像，對研究疾病發(fā)病機制、診斷形態(tài)學改變前的分子水平變化及評估相關基因介導治療效果有重要價值，其關鍵在于報告基因[3-6]。本研究將腺病毒介導轉鐵蛋白受體(transferrin receptor， TFRC)報告基因轉導入人結直腸癌(Lovo)細胞，觀察TFRC報告基因在轉染細胞的過表達情況及體外7.0T MR成像效果，觀察在體成像示蹤腫瘤的生長情況及其早期轉移機制。

1 材料與方法

1.1 材料 MR儀器采用Bruker Biospec 70/30大孔徑7.0T MR機，容積線圈，內徑40 mm，外徑75 mm。重組腺病毒載體(Ad-TFRC)和人Lovo細胞由四川大學華西醫(yī)院信號轉導及分子靶向治療研究室提供；轉鐵蛋白(transferrin，Tf)-超微超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide， USPIO)分子探針由中科院化學所合成；1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；胎牛血清FBS購自Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ad-TFRC感染Lovo細胞 將6孔板中(2×108/孔)對數(shù)生長期的人Lovo細胞置于7℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，細胞貼壁融合后,以新鮮含10% FBS的1640培養(yǎng)液替換，用于Ad-TFRC感染，以無處理Lovo細胞作為對照。將腺病毒以0、5、10、50、100的感染復數(shù)(multiplicity of infection， MOI)感染Lovo細胞，4 h后更換新鮮培養(yǎng)液。感染36 h后以熒光顯微鏡觀察熒光顯示情況，明確最佳MOI值。

1.2.2 TFRC表達定量檢測 用Ad-TFRC(Ad-TFRC組)、空病毒載體(空病毒載體組)轉染Lovo細胞，以未感染Lovo細胞作為空白對照組；分別提取各組中總RNA，應用染料法行反轉錄，檢測各組TFRC及內參GAPDH的表達。TFRC引物序列為：上游，5′-GGCTACTTGGGCTATTGTAAAGG-3′；下游，5′-CAGTTTCTC CGACAACTTTCTCT-3′。GAPDH引物序列為：上游，5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′；下游，5′-GACAAGCTTCCCGT TCTCAG-3′。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，50個循環(huán)進行擴增。用2-△△Ct解析法處理相對定量分析中所測得數(shù)據(jù)[7]。

1.2.3 探針最佳標記濃度檢測 將Ad-TFRC組、空病毒載體組及空白對照組Lovo細胞(2×104/孔)置于12孔板中生長，24 h后待細胞貼壁，而后以濃度不一(0、0.5、0.8、1.2、1.5、2.5、3.5、5.0、8.0、10.0 μg/ml)的Tf-USPIO孵育各組Lovo細胞過夜。以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution， PBS)清洗2次，每次2 min，4%多聚甲醛處理(室溫)20 min，自來水/蒸餾水分別清洗1次，每次2 min，染色劑A1∶A2按1∶1配制，混勻30 min后蒸餾水清洗5 min，用伊紅淡染細胞核2 s,自來水沖洗后封鏡，顯微鏡下觀察細胞內鐵顆粒含量。重復上述實驗3次。

1.2.4 細胞活力檢測 采用臺盼藍排除實驗檢測以Tf-USPIO(1.5 μg/ml鐵濃度)標記的Ad-TFRC組Lovo細胞24 h細胞活力變化，以無處理Lovo細胞作為空白對照組。每組重復6個樣本，實驗重復3次。

表1 各組體外細胞MRI信號強度及弛豫時間比較

圖1 Lovo細胞熒光表達 A.無處理Lovo細胞(×100)； B.感染Ad-TFRC后Lovo細胞(×100)

1.2.5 體外細胞MR成像 以Tf-USPIO(1.5 μg/ml鐵濃度)探針分別標記Ad-TFRC組、空病毒載體組和空白對照組Lovo細胞；經胰酶消化后各取1×106個細胞重懸于500 μl EP管內的0.5%瓊脂糖溶液中，配成400 μl的瓊脂糖凝膠模型。行軸位TurboRARE T2W(TR 3 000 ms,TE 5 ms)、MSME T2 map(TR 5 000 ms,TE 11 ms)、MGE T2*map(TR 1500 ms,TE 4 ms, 翻轉角 30°)序列MR掃描，層厚1 mm，矩陣256×256，視野4 cm×4 cm。應用Matlab軟件合成T2 map偽彩圖。通過Paravision 5.0后處理軟件測量T2WI信號強度及T2、T2*值，實驗重復3次，每個序列采納3層圖像，每層獲3個ROI(0.12 cm2)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析比較3組間計量資料，以獨立樣本t檢驗比較2組間計量資料。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ad-TFRC感染Lovo細胞鑒定 MOI最佳值為50。感染24 h后熒光顯微鏡開始觀察到綠色熒光蛋白，36 h后鏡下可見細胞內大量綠色熒光蛋白(圖1)，陽性感染率>90%；無處理Lovo細胞內無綠色熒光蛋白表達。

2.2 細胞TFRC mRNA的表達 Ad-TFRC組、空病毒載體組、空白對照組TFRC基因相對表達量分別為3.16±0.39、1.16±0.16、1.00±0.06，3組總體差異有統(tǒng)計學意義(F=72.47,P<0.001)，兩兩比較顯示Ad-TFRC組與空病毒載體組、空白對照組差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，空病毒載體組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 探針最佳標記濃度 光學顯微鏡示鐵濃度為1.5 μg/ml的Tf-USPIO標記的Ad-TFRC組細胞內可見存在大量藍染鐵顆粒，鐵顆粒位于胞漿內(圖2)，標記率為100%，而空病毒載體組及空白對照組僅有少量藍染鐵顆粒。

2.4 細胞活力的評價 Ad-TFRC組Lovo細胞以Tf-USPIO(1.5 μg/ml鐵濃度)探針標記24 h后，拒染率為(93.80±1.60)%，空白對照組拒染率為(95.10±2.30)%，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.489,P=0.186)。

圖2 鐵濃度為1.5 μg/ml的Tf-USPIO標記的Lovo細胞病理圖(普魯士藍，×400) A、B.空病毒載體組及空白對照組細胞中幾乎無藍色顆粒； C.Ad-TFRC組細胞內可見大量藍色顆粒，標記率為100%

圖3 相同細胞濃度的體外MR成像 從左向右依次為Ad-TFRC組、空病毒載體組、空白對照組 A.T2WI； B.T2 map；C.T2*map； D.T2 map偽彩圖

2.5 體外MR成像 MR T2W、T2 map及T2*map序列成像顯示，Ad-TFRC組、空病毒載體組、空白對照組均可檢測到低信號(圖3)。3組信號強度、弛豫時間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，兩兩比較除空病毒載體組與空白對照組，余組別差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表1。

3 討論

目前MR分子成像研究備受關注，其可獲得生理和超微解剖結構的三維信息，且空間分辨力高、無輻射，但敏感度較低[8]。本實驗采用復制缺陷型腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)其具有生物安全性好、轉染率高等諸多優(yōu)點，無需與宿主細胞基因組整合，避免了插入突變的危險；以之作為基因轉運載體，轉染后的細胞與正常狀態(tài)下培養(yǎng)的細胞形態(tài)無差別，對轉染目標細胞幾乎無傷害，與金玲等[9]研究結果一致，提示可將其作為外源性目的基因導入細胞內的工具。本實驗中根據(jù)已有研究[10]及前期實驗基礎設定病毒轉染濃度梯度，并得出最佳MOI值為50；MOI為0～50時，熒光強度相對弱，且隨MOI值增加而變強；MOI>50，熒光強度和MOI值的增加無正相關；當MOI達到100時，細胞生長狀態(tài)受影響。實時定量PCR可從mRNA水平反映轉染細胞中TFRC的正常表達。本研究結果表明，腺病毒可成功介導轉鐵蛋白受體報告基因在結直腸癌Lovo細胞中的高效表達。

USPIO是超順磁性對比劑，在磁敏感效應的作用下形成微小磁場，致磁場均勻性下降，T2縮短，T2WI上信號減低，即T2負強化效應[11]。本實驗中經Tf-USPIO探針(1.5 μg/ml鐵濃度)標記Lovo細胞后普魯士藍染色示空白對照組Lovo細胞內也存在少量藍染鐵顆粒，可能是由于在人結直腸癌Lovo細胞及大部分腫瘤細胞內源性表達的轉鐵蛋白受體較正常增高;同時細胞外無殘存鐵，可清晰顯示標識細胞的情況，但本研究未能定量檢測USPIO標記細胞內的鐵含量。

報告基因顯像屬于間接分子影像技術[12]。本研究應用USPIO納米顆粒[13]與Tf共價結合的復合物作為探針。細胞膜上的轉鐵蛋白受體靶向攝取Tf-USPIO，在胞飲作用下將結合產物轉運至細胞內，受體與探針復合物分離后回到細胞膜面，探針則留在胞內。這類是細胞表面膜受體過表達并與特異性的MR對比劑聯(lián)合成像。TFRC報告基因成像的基本機制是：通過重組DNA技術使TFRC轉導入靶細胞內，其表達引起相應TFRC增加，與耦聯(lián)Tf的報告探針特異性結合，使MRI信號增強，進而可靶向示蹤。Lee等[14]將TFRC過表達的膠質瘤細胞活體種植成瘤，利用單晶氧化鐵納米顆粒與Tf形成的復合物與TFRC特異性連合，對瘤體進行MR分子成像。報告基因顯像技術及直接用對比劑標記靶細胞方法的基礎均在于產生成像信號的細胞必須是具有活性的細胞，而報告基因顯像技術的優(yōu)勢為可在體長期觀察靶向成像，且不會因細胞分裂增殖而影響成像信號強度[15]，其缺點為操作程序復雜。

此外，在T2W、T2 map、T2*map序列成像中，本研究Ad-TFRC組、空病毒載體組、空白對照組信號強度及弛豫時間差異均有統(tǒng)計學意義，3組間以T2*變化率最大，可能與T2*map 對磁化率的差異更敏感，鐵引起的磁敏感效應更大有關，與李安寧等[16]研究結果一致。

綜上所述，腺病毒載體可以成功介導轉鐵蛋白受體報告基因轉染到體外Lovo細胞完成顯像，為下一步進行活體內腫瘤靶向示蹤MR成像提供了實驗基礎。

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