徐偉慧，呂智航，史一然，姜佳瑩，胡云龍，王志剛,*

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum & Nakai]是我國(guó)設(shè)施園藝主要栽培作物之一，隨著化肥使用率不斷增高，造成土壤理化性質(zhì)下降、土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡、根系發(fā)育不良、生長(zhǎng)勢(shì)下降等一系列問題。所以，調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)中有益微生物的種群和數(shù)量[1-2]，幫助植物建立良好的根際生長(zhǎng)條件[3-5]，是提高西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的有效手段之一。

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)具有固氮、溶磷、解磷、解鉀、分泌植物激素、產(chǎn)生鐵載體，改善土壤環(huán)境，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆能力等多種促生效應(yīng)[6]。解磷菌是將土壤中有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群，也稱為有機(jī)磷細(xì)菌[7]，在轉(zhuǎn)化土壤有機(jī)磷和提高磷肥利用率及植物生長(zhǎng)等方面有顯著作用[4]。溶磷菌是將土壤中難溶性無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的形態(tài)，也稱為無機(jī)磷細(xì)菌[8-9]。PGPR中產(chǎn)激素菌可以分泌調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)物質(zhì)，如吲哚乙酸和赤霉素。吲哚乙酸具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)生根等功能[10]。赤霉素和生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)大和組織分化方面有相互疊加的作用[11]。一些促生菌分泌鐵載體可抑制某些植物病原菌，同時(shí)作為根際鐵的提供者促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。

PGPR作為植物促進(jìn)方面的接種劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著重要的作用[13]。Serratiaproteamaculans會(huì)增加鷹嘴豆(Cicerarietinum)根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)量和長(zhǎng)度及根質(zhì)量[14]；接種Azospirillumbrasilense會(huì)增加菜豆根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量、降低根系直徑，增加細(xì)根在總根長(zhǎng)中的比例[15]；王志剛等[5，16-17]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)接種Sphingomonassp. CL01、PantoeaananatisHYL01和Plantibactersp.WZW03會(huì)增加西瓜根長(zhǎng)、根干質(zhì)量、根體積、根尖數(shù)，顯著增加根系直徑0～0.5 mm根長(zhǎng)所占總根長(zhǎng)的比例，對(duì)西瓜根系具有明顯的促生效應(yīng)。

PGPR是促生微生物肥料的主要菌種類群。近年來，因微生物肥料的開發(fā)對(duì)菌種的需求，使植物根際促生菌的篩選成為研究熱點(diǎn)。利用不同功能菌株組合、功能互補(bǔ)并篩出復(fù)合菌劑，是微生物菌劑研究應(yīng)用向多菌復(fù)合發(fā)展的趨勢(shì)[18]。本研究基于本實(shí)驗(yàn)室篩選的解磷菌、溶磷菌、固氮菌和解鉀菌，研究菌株分泌IAA、赤霉素和鐵載體的能力及菌株間的拮抗作用，篩出復(fù)合菌劑；通過盆栽試驗(yàn)研究多功能復(fù)合菌對(duì)西瓜幼苗根系生長(zhǎng)的促生效應(yīng)，為開發(fā)復(fù)合菌劑、提高西瓜產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自齊齊哈爾市嫩江邊黑土，土壤基本性狀為，有機(jī)質(zhì)18.26 g·kg-1，堿解氮30.59 mg·kg-1，有效磷28.26 mg·kg-1，速效鉀83.12 mg·kg-1，土壤pH 6.02，EC 0.59 ms·cm-1。供試西瓜品種為京欣1號(hào)，購買于北京金種子公司。供試菌株由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院微生物生態(tài)實(shí)驗(yàn)室從西瓜根際篩選獲得，菌株類型及編號(hào)見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌株分泌激素及鐵載體的測(cè)定

制備菌株種子液，測(cè)定不同解磷菌、溶磷菌、固氮菌和解鉀菌分泌IAA、赤霉素和鐵載體的能力。

菌株分泌IAA測(cè)定。IAA測(cè)定參考張東艷等[6]的方法。將200 μg·mL-1的IAA標(biāo)準(zhǔn)液按濃度梯度0、25、50、75、100、125、150、175 μg·mL-1進(jìn)行稀釋，采用Salkowski顯色法測(cè)定吸光值(D530)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將菌株接于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)(30 ℃，120 r·min-1)24 h制作種子液，按1%的接種量將種子液接入含有200 mg·L-1色氨酸的液體LB培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)(30 ℃，120 r·min-1)，每24 h采用Salkowski顯色法定量測(cè)定IAA，連續(xù)測(cè)量5次。

鐵載體測(cè)定。鐵載體測(cè)定參考胡碧惠等[19]的方法。將待測(cè)菌株接種于MKB液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床(120 r·min-1)培養(yǎng)48 h，離心菌懸液取上清，將3 mL上清液與3 mL CAS 檢測(cè)液充分混勻，反應(yīng)1 h，于630 nm處測(cè)定吸光值 (As)。另取3 mL不接菌MKB液體培養(yǎng)基與3 mL CAS檢測(cè)液充分混合，于630 nm處測(cè)定吸光值(Ar)。鐵載體含量測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[20]進(jìn)行計(jì)算。

菌株分泌赤霉素的測(cè)定。赤霉素的測(cè)定參考肖志壯等[21]的方法。將分析純赤霉素溶于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中配置成100 μg·mL-1的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)液，按濃度梯度0、10、30、40、50、60 μg·mL-1進(jìn)行稀釋，取各濃度的赤霉素溶液0.5 mL與4.5 mL 濃硫酸充分混勻，置于冰浴中10 min，再置28 ℃水浴中1 h，取出置室溫下放置15 min，測(cè)定412 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將菌株接種于LB培養(yǎng)基中，置于搖床(30 ℃，120 r·min-1)上振蕩培養(yǎng)24 h制備種子液，按1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基中，搖床振蕩(30 ℃，120 r·min-1)培養(yǎng)，每24 h離心(10 000 r·min-1，10 min)取上清測(cè)定菌株赤霉素濃度，連續(xù)測(cè)5次，確定各菌株最大赤霉素分泌量。

1.2.2 菌株間的拮抗試驗(yàn)

選擇解磷菌、溶磷菌、固氮菌和解鉀菌中的一種分別與其他菌株在同一固體培養(yǎng)基中進(jìn)行點(diǎn)培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，觀察兩菌落之間是否存在抑菌帶及抑菌帶的寬度和菌種的拮抗方向等，存在明顯拮抗帶的為拮抗陽性，相反的就是拮抗陰性[22]。選擇相互協(xié)同或無拮抗作用的菌株進(jìn)行4菌組合，最終作為供試的復(fù)合菌劑。每一組合的菌液按照1∶1∶1∶1(體積比)的比例混合，復(fù)合菌懸液的濃度為D600=0.5。

1.2.3 復(fù)合菌劑對(duì)西瓜促生試驗(yàn)

西瓜種子用0.1%升汞消毒8 min，無菌水浸泡8 h，30 ℃無菌催芽，待西瓜胚根長(zhǎng)至0.5 cm左右時(shí)分別將西瓜種子播種到滅菌土和非滅菌土的育苗盤中。待西瓜兩片子葉展平，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別移至裝有滅菌土和非滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽中(10 cm×10 cm，裝有223 g土)，同時(shí)，分別澆灌3種復(fù)合菌劑(R1、R2、R3)10 mL，非滅菌土壤以澆灌清水(CK1)為對(duì)照，滅菌土壤以澆灌無菌水(CK2)為對(duì)照，幼苗置于人工氣候箱中培養(yǎng)(28 ℃/光照12 h，18 ℃/黑暗12 h，濕度為60%)，試驗(yàn)期間采用稱量法分別澆灌清水(非滅菌土壤)和無菌水(滅菌土壤)，每個(gè)處理重復(fù)20盆。不同處理對(duì)應(yīng)編號(hào)如表2所示。

表2 不同處理對(duì)應(yīng)編號(hào)Table 2 Number of different treatments

表中“—”指未進(jìn)行處理。
“—” represents no treatment.

處理30 d后收集西瓜根系采用稱量法測(cè)量地下部干質(zhì)量，用根系分析儀(ScanMaker i800 plus)掃描并獲得根系圖像，根系分析軟件(Scan Wizard EZ)分析根系長(zhǎng)度、根體積、根表面積、根系平均直徑、根尖數(shù)等[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin 9和SPSS軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分泌IAA、赤霉素和鐵載體的能力

圖1 供試菌株分泌IAA、赤霉素和鐵載體的能力Fig.1 Ability of experimental strains to secrete IAA and gibberellin and product siderophores

定量測(cè)定結(jié)果顯示(圖1)，菌株StreptomycesCL05分泌IAA量最多，達(dá)到117.30 mg·L-1，而菌株LS06、LS04、LS05、WZW03 分泌IAA的量相對(duì)較高，分別為103.60、98.10、95.40、89.41 mg·L-1。其余菌株分泌IAA量均分布在30～85 mg·L-1。此外，分泌鐵載體活性最高的菌株是StreptomycesCL05，其活性為69.43%；其他菌株產(chǎn)鐵載體活性由高到低依次為L(zhǎng)S05(45.85%)、LS04(44.54%)、WZW03(30.68%)、HYL02(22.71%)、LS06(22.27%)、HYL01(18.27%)、HYL03(9.71%)、CL01(5.67%)，而菌株CL02、CL03、LS01不具有產(chǎn)鐵載體的能力。菌株MicromonosporaLS05分泌赤霉素的量最高，其分泌量是12.66 mg·L-1，其次是解鉀菌WZW03，分泌赤霉素的量為10.59 mg·L-1，而菌株HYL01、HYL03和LS01均不分泌赤霉素，其余菌株分泌量在0.50～8.17 mg·L-1。

2.2 菌株間的拮抗效果

利用平板對(duì)峙法研究了3株溶磷菌、4株解磷菌、4株固氮菌和1株解鉀菌間的拮抗作用，表3所示，菌株CL02和CL01與3株溶磷菌均沒有拮抗作用，菌株CL03與菌株HYL02沒有拮抗作用，菌株CL05與菌株HYL02和HYL03沒有拮抗作用；菌株HYL01對(duì)菌株CL03和CL05均有拮抗；菌株LS01對(duì)3株溶磷菌均有拮抗，菌株LS04對(duì)菌株HYL03有拮抗作用。4株解磷菌與4株固氮菌間無拮抗作用。菌株CL02和LS01對(duì)解鉀菌株WZW03有拮抗作用；其他供試菌株對(duì)解鉀菌株WZW03無拮抗作用。根據(jù)以上分析結(jié)果，對(duì)菌種間無拮抗作用的菌株進(jìn)行組合，最終選擇出無拮抗作用的3種復(fù)合菌劑，分別是：復(fù)合菌劑R1，CL03+LS04+HYL02+WZW03；復(fù)合菌劑R2，CL03+LS05+HYL02+WZW03；復(fù)合菌劑R3，CL05+LS05+HYL03+WZW03。

2.3 三組復(fù)合菌劑對(duì)西瓜根系生長(zhǎng)的影響

復(fù)合菌劑處理30 d后，用水浸泡營(yíng)養(yǎng)缽中的土壤，輕輕取出西瓜根系，清水緩緩沖洗掉根系上的土壤，用根系分析儀掃描西瓜幼苗根系并進(jìn)行拍照，見圖2。由表4可知，在非滅菌土壤中，復(fù)合菌劑R2顯著提高了西瓜根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)和根干質(zhì)量(P<0.05)。與對(duì)照相比，復(fù)合菌劑R2對(duì)西瓜幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)和根干質(zhì)量分別提高了79.0%、46.8%、57.1%、162.7%、49.1%。復(fù)合菌劑R1和R3處理的西瓜幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根干質(zhì)量與對(duì)照相比無顯著差異，顯著提高了根尖數(shù)(P<0.05)。

在滅菌土壤中，3組復(fù)合菌劑處理西瓜幼苗根系形態(tài)圖，見圖3。由表5可知，在滅菌土壤中，復(fù)合菌劑R2S顯著提高了西瓜幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)和根干質(zhì)量，顯著降低了根系平均直徑(P<0.05)。與對(duì)照相比，復(fù)合菌劑R2S對(duì)西瓜幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)和根干質(zhì)量分別提高了191.8%、302.4%、160.0%、206.5%、139.6%，根系平均直徑比對(duì)照降低了17.5%。復(fù)合菌劑R1S和R3S處理顯著提高了西瓜幼苗根長(zhǎng)、根尖數(shù)和根干質(zhì)量，而根表面積、根體積、根系平均直徑與對(duì)照相比無顯著差異(P<0.05)。

表3 供試菌株間的拮抗作用Table 3 Antagonistic effect among experimental strains

表中“+”表示豎排菌種對(duì)橫排菌種拮抗；“-”表示橫排菌種對(duì)豎排菌種拮抗；“=”表示互相拮抗；“0”表示無拮抗。下同。
“+” represents the antagonism of the strain in the vertical line to the strain in the horizontal lines; “-” represents the antagonism of the strain in the horizontal line to the strain in the vertical lines; “=” represents the antagonism between the strains in the horizontal and vertical lines; “0” represents no antagonism. The same as below.

圖2 未滅菌土壤中復(fù)合菌劑處理的西瓜幼苗根系形態(tài)Fig.2 Roots morphology of watermelon seedlings in unsterilized soil after complex bacteria treatment

表4 未滅菌土壤中復(fù)合菌劑對(duì)西瓜幼苗根系的影響Table 4 Effects of complex bacteria on growth of watermelon roots in unsterilized soil

表中同列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。
The values without the same lowercase letters in the same column showed the significant difference atP<0.05. The same as below.

圖3 滅菌土壤中復(fù)合菌劑處理的西瓜幼苗根系形態(tài)Fig.3 Roots morphology of watermelon seedlings in sterilized soil after complex bacteria treated

表5 滅菌土壤中復(fù)合菌劑對(duì)西瓜幼苗根系的影響Table 5 Effects of complex bacteria on growth of watermelon roots in sterilized soil

3 討論

復(fù)合菌劑的使用能有效改善土壤微生物區(qū)系，有效提高土壤酶活力，抑制病害發(fā)生，減緩連作障礙[24]。構(gòu)建復(fù)合菌劑是根據(jù)菌株間的拮抗性或者促抑關(guān)系，將功能菌株進(jìn)行優(yōu)化組合[25-26]。本研究利用實(shí)驗(yàn)室篩選的不同溶磷菌、解磷菌、固氮菌及解鉀菌菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，并最終獲得無拮抗作用的復(fù)合菌劑R1、R2和R3。R2和R2S處理能有效提高西瓜幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)和根干質(zhì)量，R2S處理能有效降低西瓜根系直徑，說明該復(fù)合菌劑能促進(jìn)毛細(xì)根的生成，優(yōu)化西瓜根系。李勤奮等[26]施用復(fù)合菌劑C1和C2能明顯促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)，其他幾個(gè)研究也證實(shí)了PGPR菌株混合物由于協(xié)同作用具有更好的促生和生防效果[27-28]。本實(shí)驗(yàn)中R2S處理對(duì)西瓜根系的促生效果優(yōu)于R2，可能原因是在非滅菌土壤中復(fù)合菌劑R2與土壤中某些或某個(gè)菌種存在養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)或拮抗作用，導(dǎo)致R2復(fù)合菌群的繁殖受到影響，這個(gè)現(xiàn)象可歸功于土壤中總微生物的活性[29]。

PGPR除了促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收外[5，16-17]，還可通過產(chǎn)生植物激素、嗜鐵素等物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[30]。大部分PGPR可以產(chǎn)生IAA，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育[31]，增加次生根和根毛的數(shù)量[32]。構(gòu)建復(fù)合菌劑R1、R2和R3的菌株都具有較高分泌IAA的能力，顯然這不是復(fù)合菌劑R2優(yōu)于R1和R3的主要原因。赤霉素和生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)大和組織分化方面有相互疊加的作用[11]。構(gòu)成復(fù)合菌劑R2的4種菌株CL03、LS05、HYL02、WZW03產(chǎn)赤霉素和IAA的能力都較強(qiáng)，復(fù)合菌劑R2與R1比較，兩種復(fù)合菌劑有共同的菌株(CL03、HYL02、WZW03)，差異菌株是LS05(R2)和LS04(R1)，LS05菌株分泌赤霉素的濃度是12.65 mg·L-1，LS04菌株分泌赤霉素的濃度是2.13 mg·L-1，同樣，R2與R3比較，差異菌株CL03和HYL02(R2中含有)分泌赤霉素的濃度分別是8.17 mg·L-1和6.10 mg·L-1，而菌株CL05和HYL03(R1中含有)分泌赤霉素的濃度分別是0.59 mg·L-1和0 mg·L-1，因此，復(fù)合菌劑R2的4株菌分泌赤霉素的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過R1和R3的菌株，這可能是復(fù)合菌劑R2對(duì)西瓜根系促生效果優(yōu)于R1和R3的主要原因。鐵元素是生物體必需元素之一，土壤中能夠被生物利用的鐵元素很少，PGPR產(chǎn)嗜鐵素與鐵結(jié)合，從而被植物吸收利用，促進(jìn)生長(zhǎng)[33-34]。復(fù)合菌劑R2與R1比較，除了共有的菌株外，差異菌株產(chǎn)鐵載體的量大致相同，菌株LS05產(chǎn)鐵載體為45.85%，菌株LS04產(chǎn)鐵載體量為44.54%，二者無顯著差異，R2與R3比較，R3的4種菌株產(chǎn)鐵載體總量遠(yuǎn)高于R2的4種菌株，說明優(yōu)勢(shì)復(fù)合菌劑與復(fù)合菌劑中菌株產(chǎn)鐵載體的總量無相關(guān)性。復(fù)合菌劑R2成為優(yōu)勢(shì)菌劑有可能還存在其他原因，仍需進(jìn)一步研究證明。從本實(shí)驗(yàn)供試菌株分泌IAA、GA和產(chǎn)鐵載體的能力看，分泌IAA和GA的能力高產(chǎn)鐵載體的能力不一定高，如菌株CL03具有較高分泌IAA和GA的能力，但不具有產(chǎn)鐵載體的能力；具有產(chǎn)鐵載體和分泌IAA的能力，分泌赤霉素的能力不一定高，如菌株HYL03，說明菌株分泌IAA、GA和產(chǎn)鐵載體無相關(guān)性。

本研究結(jié)果證實(shí)，復(fù)合菌劑R2對(duì)西瓜根系具有促生效應(yīng)，其在復(fù)雜的大田環(huán)境下的應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，進(jìn)一步研究復(fù)合菌劑最優(yōu)載體的篩選，可為多功能復(fù)合菌肥的開發(fā)利用提供理論參考。

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