楊 娟，米其利，熊 文，朱瑞芝，樓牧夢，夭建華，*，羅義勇，*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，云南 昆明 650106)

煙葉陳化，又稱煙葉發(fā)酵，是煙草加工過程中的一個(gè)重要加工單元。煙葉陳化實(shí)質(zhì)是在一定溫度和濕度條件下，煙葉理化特性發(fā)生深刻變化，煙葉香氣、色澤和吸味品質(zhì)明顯改善的加工過程。煙葉陳化分為自然陳化和人工陳化。自然陳化指煙葉在自然條件下進(jìn)行長時(shí)間發(fā)酵的一種方法；人工陳化是通過人為控制發(fā)酵的溫度和濕度，在短時(shí)間內(nèi)顯著改善煙葉品質(zhì)的一種方法。人工陳化可大大縮短發(fā)酵時(shí)間，但發(fā)酵后煙葉內(nèi)各種成分比例不協(xié)調(diào)，發(fā)酵效果差；自然陳化對煙葉改善效果好，但耗時(shí)較長，易造成庫存積壓，影響經(jīng)濟(jì)效益。另外，在長期倉儲陳化過程中，煙葉易霉變和長蟲，給煙草企業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

據(jù)報(bào)道，陳化煙葉表面存在大量微生物群落，包括占絕對優(yōu)勢細(xì)菌、少量放線菌和真菌[1-2]。縮短發(fā)酵時(shí)間、增進(jìn)煙葉香氣、調(diào)控?zé)熑~有害成分(如煙堿、亞硝胺等)是微生物作用陳化煙葉的3個(gè)主要功能[3]。微生物改善陳化煙葉吸食品質(zhì)的原因主要有以下兩方面：1)進(jìn)行代謝活動(dòng)降解或消耗煙葉中一些大分子物質(zhì)(如糖類、脂類和蛋白質(zhì)等)，改善了煙草的吃味，增加余味；2)通過代謝產(chǎn)生某些致香小分子物質(zhì)(如醇類、酯類、酸類和雜環(huán)類等)，使煙葉各種成分比例趨于平衡，提高煙葉質(zhì)量。

將微生物資源應(yīng)用于煙葉發(fā)酵是改善煙葉品質(zhì)和增進(jìn)煙葉香氣的一種重要措施。早在1958年，Izquierdo[4]發(fā)現(xiàn)，接種微生物發(fā)酵的煙葉香氣和性狀均得到改善，采用微球菌屬(Micrococcus)或芽孢桿菌屬(Bacillus)或兩者的混合物接種煙葉時(shí)，效果更為顯著。English等[5]利用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)分別或混合發(fā)酵煙葉后，能迅速產(chǎn)生一種令人愉悅的香氣。黃靜文等[6]將短小芽孢桿菌(B.pumilum)菌劑噴施于煙絲發(fā)酵21 d后，煙葉化學(xué)成分比例更加協(xié)調(diào)，煙香和煙氣增加，刺激性降低，卷煙吸味顯著改善。此外，利用微生物酶制劑處理改善煙葉品質(zhì)和香氣的報(bào)道也較多。李雪梅等[7]用煙堿降解活性較高菌株Nic22的粗酶液處理上部煙葉，評吸結(jié)果顯示，經(jīng)酶液處理后的煙葉可明顯減輕雜氣和刺激性，提高卷煙感官質(zhì)量。

乳酸菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的主要菌群，長期定居于人類腸道并有益于人體健康，是公認(rèn)的食品級安全微生物，被廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪、饅頭等食品的風(fēng)味塑造。目前，應(yīng)用在煙葉上的微生物大多分離自煙葉表面或土壤中，鑒定發(fā)現(xiàn)有些是條件致病菌[8]，所以存在一定安全隱患。食品來源有益微生物應(yīng)用在煙葉發(fā)酵上的報(bào)道較少，而利用乳酸菌改善煙葉風(fēng)格的報(bào)道僅有2例。甄達(dá)文等[9]在利用酶制劑和微生物發(fā)酵制備煙用香料時(shí)發(fā)現(xiàn)，德氏乳酸菌(Lactobacillusdebrueckii)+生香酵母組合發(fā)酵制得的香料，增香效果明顯，感官評吸效果最佳。潘家華等[10]報(bào)道了一種加速煙葉陳化和提升煙葉品質(zhì)的復(fù)合微生物制劑專利，該制劑包括植物乳桿菌(L.plantarum)和熱醋酸桿菌(Clostrioliumthemoacidophilus)，發(fā)酵煙葉后，可增加卷煙陳化酸香和柔和細(xì)膩煙氣，降低卷煙刺激性，使卷煙的吸食口感變好。本研究從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中分離得到了兩株植物乳桿菌L8和L14菌株，將其菌劑用于煙葉發(fā)酵，并優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)香條件以及研究發(fā)酵后對卷煙化學(xué)成分和致香成分的影響，旨在探討利用食品級乳酸菌改善煙葉品質(zhì)的可行性。

1 材料與方法

1.1 煙葉、煙絲和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)用煙葉由云南中煙有限責(zé)任公司原料部提供，品種為K326，具有1年陳化齡；煙絲是從商品化云煙紫云中抽出，用于后續(xù)菌種篩選、感官評吸和致香成分測定。

MRS液體培養(yǎng)基組分如下：1%蛋白胨，0.8%牛肉粉，0.4%酵母粉，2%葡萄糖，0.1%吐溫80，0.2% K2HPO4，0.5% NaAc，0.2‰ MgSO4，0.05‰ MnSO4，0.2%檸檬酸三銨，pH 6.2，配制后置于滅菌鍋中115 ℃滅菌20 min；用于食源性乳酸菌的培養(yǎng)和保藏。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂。

改良MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中添加1% CaCO3、0.04‰溴甲酚紫和1.5%瓊脂，115 ℃滅菌20 min，用于食源性乳酸菌篩選。

煙葉培養(yǎng)基由0.8%煙葉粉末(由煙葉在研缽中研磨而成)和1.5%瓊脂配制而成，115 ℃滅菌20 min后，倒平板，用于篩選以煙葉為唯一營養(yǎng)源的乳酸菌。

1.2 乳酸菌的分離與鑒定

從云南各州縣采集豆豉樣品若干份，利用改良MRS固體培養(yǎng)基篩選乳酸菌，單菌落在MRS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，保存于-80 ℃冰箱中。隨機(jī)選取10株乳酸菌，在煙葉培養(yǎng)基中劃線分離，37 ℃培養(yǎng)48 h。選取2株長勢最好菌株，接種于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)，并且參照Adnan等[11]報(bào)道方法進(jìn)行生理生化分析。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒(中國百泰克公司)提取L8和L14基因組DNA。然后，以16S rRNA和dnaK基因?yàn)榉肿覯arker，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序和序列在線檢索。最后，結(jié)合形態(tài)、生理生化和分子分析結(jié)果，確定菌株身份信息。

1.3 菌株生長曲線和產(chǎn)酸曲線

從-80 ℃冰箱中取出菌株保藏液，按4‰(V/V)接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化。活化好的菌液按4‰(V/V)接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)40 h。每隔2 h取樣4 mL，其中3 mL用于D600和pH測定；1 mL用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-8和10-9兩個(gè)稀釋度各100 μL涂布于MRS固體平板，30 ℃靜止培養(yǎng)18 h后，記錄菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 煙絲發(fā)酵和發(fā)酵條件優(yōu)化

用切絲機(jī)將煙葉切成煙絲，稱取含水率為12%煙絲30 g，噴施6 mL乳酸菌菌劑(濃度為1×109CFU·mL-1，菌齡為20 h)，裝入無菌食品袋中，30 ℃，60%濕度，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d后，制成卷煙。為獲得最佳發(fā)酵條件，按照正交實(shí)驗(yàn)表(表1)對接菌量、發(fā)酵溫度、菌齡和煙葉產(chǎn)地進(jìn)行優(yōu)化。

另外，以紫云煙絲為發(fā)酵材料，采用正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件，進(jìn)行發(fā)酵并制作卷煙。對照樣品為等量無菌水代替乳酸菌菌劑，其他步驟同相應(yīng)發(fā)酵卷煙。

1.5 感官評吸

將各種發(fā)酵卷煙和相應(yīng)對照樣品隨機(jī)編號，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中平衡24 h后，由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心組織5名省級評吸專家進(jìn)行評吸。煙葉感官質(zhì)量按照表2所述指標(biāo)和評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)，評吸得分越高，卷煙抽吸品質(zhì)越好，反之亦然。每個(gè)樣品重復(fù)評吸3次。

1.6 煙樣化學(xué)成分測定

以紫云發(fā)酵煙絲和對照樣品為檢測對象，采用連續(xù)流動(dòng)分析法，參考煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2002、YC/T 468—2013、YC/T 468—2013，分別測定總糖和還原糖，總氮，總植物堿的含量。

1.7 煙樣致香成分分析

1.7.1 頂空-固相微萃取技術(shù)分離致香成分

分別稱取0.5 g紫云發(fā)酵煙絲和對照樣品于頂空瓶中，插上老化好的萃取頭，將石英纖維頭推出使其暴露在頂空瓶頂空中，在電熱恒溫水浴鍋中60 ℃萃取40 min后，將吸附好待分析組分的萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣器中。

1.7.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定和分析致香成分氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAXetr型毛細(xì)管柱(60 mm×0.25 mm×0.25 μm)(美國Agilent公司)；程序升溫為初始溫度60 ℃，保持5 min；以2 ℃·min-1的升溫速率升至200 ℃；再以10 ℃·min-1的升溫速率升至240 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度180 ℃；載氣為高純氦氣；恒流模式，柱流量1.5 mL·min-1，分流比10∶1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factor levels

—表示該水平未設(shè)置。
— indicates level 3 was not set.

表2 感官評價(jià)指標(biāo)和評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation index and scoring standard

—表示術(shù)語和賦值不存在；括號里數(shù)據(jù)表示評吸分值。
— indicates terminology and assignment not existed; Data in parentheses represent smoking score.

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源；電離能量70 eV；傳輸線溫度180 ℃；離子源溫度200 ℃；溶劑延遲4 min；檢測離子范圍為33～400 amu。

對采集到的質(zhì)譜圖利用Wiley和NIST譜庫進(jìn)行串聯(lián)檢索，確定揮發(fā)性成分種類，并利用峰面積歸一化法計(jì)算各成分在樣品中的相對含量。每個(gè)煙樣重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22軟件包中的Student’s t-test分析對照和處理煙樣中的數(shù)據(jù)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 以煙葉為唯一營養(yǎng)源的乳酸菌篩選和鑒定

在改良MRS固體平板上，菌落顏色為淡黃色或者乳白色，菌落周圍紫色溴甲酚紫變?yōu)辄S色，且有明顯溶鈣圈的單菌落，初步確定為乳酸菌。在10株乳酸菌中，6株能在煙葉固體培養(yǎng)基上生長，將長勢最好的兩株分別命名為L8和L14，作為下一步實(shí)驗(yàn)菌株。L8和L14菌落形態(tài)規(guī)則、圓形、中間隆起、乳白色、表面光滑、邊緣整齊。顯微觀察發(fā)現(xiàn)L8和L14均為短桿狀，無鞭毛，革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性。分子生物學(xué)鑒定分析顯示，菌株L8和L14的16S rDNA 和dnaK序列與植物乳桿菌均具有很高的同源性(大于99%)。這些結(jié)果可確定L8和L14均為植物乳桿菌。

2.2 菌株L8和L14的生長和產(chǎn)酸特性研究

生長曲線分析顯示，L8從6 h進(jìn)入指數(shù)生長期，在14 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，22 h后菌落數(shù)和D600值開始下降，推測其可能開始進(jìn)入衰亡期(圖1-A)。與L8不同，L14大約在6、20和34 h分別進(jìn)入指數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期和衰亡期(圖1-B)。產(chǎn)酸曲線顯示L8和L14相似，pH值從最初6.1～6.4開始緩慢下降到指數(shù)生長初期的5.7～6.0，然后急劇下降，在指數(shù)末期兩菌株均下降了2.0～2.2，最后在穩(wěn)定期和衰亡期維持在3.3～3.6(圖1)，說明L8和L14均具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力(圖1-B)。

CFU表示菌落形成單位。CFU denotes the colony-forming unit.圖1 L8(A)和L14(B)生長和產(chǎn)酸曲線Fig.1 The curves of growth and acid production of L8 (A) and L14 (B)

2.3 卷煙感官評吸和產(chǎn)香發(fā)酵條件優(yōu)化

用L8和L14發(fā)酵陳化煙葉，制得的卷煙按實(shí)驗(yàn)所述方法進(jìn)行感官評吸。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵卷煙比對照雖然煙味較淡，但整體口感更好，煙氣細(xì)膩醇和，入口滑順，雜氣、刺激性和苦辣味明顯減輕，酸香味明顯增加。按照表2所述評分指標(biāo)和評分標(biāo)準(zhǔn)，在總評分為45的情況下，L8和L14發(fā)酵卷煙分值顯著高于對照(表3)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，L8和L14發(fā)酵卷煙在接菌量為1×108CFU·mL-1、發(fā)酵溫度為37 ℃、菌齡為10 h和煙葉產(chǎn)地為云南保山的條件下，感官評吸值均最高，分別為34.1和33.41(表4)，表明上述條件為L8和L14的最佳產(chǎn)香發(fā)酵條件。

為了更直觀、明確地評價(jià)L8和L14對卷煙吃香味的影響，以紫云煙絲為發(fā)酵材料，選取去除煙葉產(chǎn)地外的最優(yōu)產(chǎn)香發(fā)酵條件制備發(fā)酵卷煙。感官評吸表明，L8和L14發(fā)酵卷煙分值均大于對照(表3)，具體來說，發(fā)酵后卷煙雖然香氣量較少，但協(xié)調(diào)性更好，雜氣和刺激性減少，酸香味增強(qiáng)，余味干凈，說明乳酸菌L8和L14能顯著改善煙葉吸食品質(zhì)。

2.4 煙樣經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的化學(xué)成分變化

主要常規(guī)化學(xué)成分分析結(jié)果表明，紫云煙絲經(jīng)L8和L14發(fā)酵后，總氮和總植物堿含量沒有變化，但總糖和總還原糖含量顯著減少，造成糖氮比由10.11降低至9.41和9.51，糖堿比由9.16降低至8.49和8.59(表5)。

2.5 煙樣經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的致香成分變化

由表6可知，經(jīng)L8和L14處理后，煙絲中致香物質(zhì)的種類主要包括酸、醛、酮、醇等4大類，它們含量均超過了10%，其中醛的含量最多。具體來說，L8和L14發(fā)酵煙絲較對照增加(例如2-甲基丁酸)或減少(例如壬醛)了一些化合物種類，但這些化合物含量均很少。含量較多且變化很明顯的化合物有乙酸和3-甲基丁醛，其中乙酸含量增加了9.17%～11.89%，3-甲基丁醛含量減少了7.90%～8.43%，使得總酸含量和總?cè)┖糠謩e顯著增加和減少。另外，一些含量較少但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示發(fā)酵煙絲與對照間存在顯著性差異的化合物有：丙酸、5-甲基呋喃醛、2-甲基呋喃、三氯甲烷和1，3-二甲基苯。這些化合物含量變化可能是L8和L14改善煙葉吸食品質(zhì)的主要原因。值得一提的是，L14比L8對煙葉改造似乎更具效果，例如乙酸的增加量和3-甲基丁醛的減少量在L14發(fā)酵煙絲中均最大；另外，L14顯著降低煙堿含量，但L8與對照差異不顯著(表6)。

表3 L8和L14發(fā)酵卷煙感官評吸Table 3 Sensory evaluation of L8 and L14 fermented tobacco

—表示未測定；*和**分別表示相比于對照，L8或L14具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)。下同。
— indicates no determination;*and**represents the significance between L8 or L14 and the control (P<0.05 andP<0.01) , respectively. The same as below.

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test design

表5 L8和L14處理對煙絲主要化學(xué)成分的影響Table 5 The impact of L8 and L14 on the chemical components in cut tobacco

表6 L8和L14發(fā)酵對煙絲致香成分的影響Table 6 Effect of L8 and L14 fermentation on volatile aroma components in cut tobacco

續(xù)表6

相對含量指一種煙絲中單一化合物峰面積占總化合物峰面積的比例；—，未檢測到；M2B，2-甲基-2-丁烯醛；M1B，3-甲基-1-丁醇；M2FM，5-甲基-2-呋喃甲醇；M2H，6-甲基-2-庚醇；EMMD2K，(E)-8-甲基-5-(1-甲基乙基)-6，8-壬二烯-2-酮；MA2K，6-甲基-5-庚烯-2-酮；EMKB1K，(E)-1-(2，6，6-三甲基-1，3-環(huán)己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；MTF3K，2-甲基四氫呋喃-3-酮；CTK，2-環(huán)戊烯-1，4-二酮； MP4K，2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮；A2A，乙酰氧基-2-丙酮；PGD，1，2-丙二醇二乙酸酯；TN，1，2，3，4-四氫-1，1，6-三甲基萘；HMI，2，3-二氫-1，1，5，6-四甲基-1H-茚。
The relative content refers to the ratio of the peak area of the single compound to the peak area of the total compound in a kind of tobacco; —，not detected; M2B，2-methyl-2-butenal; M1B，3-methyl-1-butanol; M2FM，5-methyl-2-furancarbinol; M2H，6-methyl-2-heptanol; EMMD2K，(E)-8-methyl-5-(1-methylethyl)-6，8-nondiene-2-one; MA2K，6-methyl-5-heptadien-2-one; EMKB1K，(E)-1-(2，6，6-trimethyl-1，3-cyclohexadien-1-yl)-2-buten-1-one; MTF3K，2-methyltetrahydrofuran-3-one; CTK，2-cyclopentene-1，4-diketone; MP4K，2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one; A2A，acetyl oxygen-2-acetone; PGD，1，2-propyleneglycol diacetate; TN，1，2，3，4-tetrahydro-1，1，6-trimethyl-naphthalene; HMI，2，3-dihydro-1，1，5，6-tetramethyl-1H-indene.

3 討論

利用微生物發(fā)酵，能減弱煙葉中雜氣和刺激性，提高煙葉吃香味，顯著改善煙葉品質(zhì)和等級[4-5，12]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)L8和L14發(fā)酵處理后的煙葉，煙氣細(xì)膩醇和，雜氣和刺激性明顯減弱，酸香味突顯，余味干凈，說明乳酸菌能改善煙葉吸食品質(zhì)，是一類潛在卷煙風(fēng)味改善菌種資源。

煙葉化學(xué)成分是煙葉吃吸味的物質(zhì)基礎(chǔ)。微生物發(fā)酵能夠加速煙葉化學(xué)成分變化，縮短煙葉陳化時(shí)間。相對于對照，L8和L14發(fā)酵煙絲的糖氮比和糖堿比均有不同程度下降(表5)，但均位于烤煙糖氮比和糖堿比最佳范圍[13]，這和瞿嬌嬌等[14]應(yīng)用食品微生物改善煙葉品質(zhì)的研究結(jié)果一致。這些變化可能使煙葉的糖、氮和堿等主要化合物及其比值更加趨于平衡，促進(jìn)煙葉品質(zhì)改善。

致香成分變化結(jié)果顯示，經(jīng)L8和L14處理后，煙絲中一些化合物種類發(fā)生了改變，但這些化合物含量均很少(表6)，很難說明這些化合物種類的改變是由于實(shí)驗(yàn)誤差還是由乳酸菌發(fā)酵造成的，所以總體來說，乳酸菌發(fā)酵處理對煙絲致香成分的種類改變不明顯。在化合物含量方面，發(fā)酵后煙絲的總酸(尤其是乙酸)含量增加，總?cè)?尤其是3-甲基丁醛)含量減少(表6)，推測3-甲基丁醛可能通過乳酸菌代謝生產(chǎn)乙酸。由于戊醛、丁烯醛類等醛類物質(zhì)在煙氣中往往引起吸食刺激，雜氣重，余味差[15]，而有機(jī)酸可以減少卷煙雜氣和刺激，提高細(xì)膩度和圓潤感，改善余味，有利于煙葉的吸味品質(zhì)提高[9]。

在本研究中，我們篩選和鑒定了2株乳酸菌(植物乳桿菌L8和L14)，并繪制了這2種菌株的生長和產(chǎn)酸曲線。利用L8和L14發(fā)酵煙絲，感官評吸結(jié)果表明L8和L14能顯著提高卷煙吸食品質(zhì)，并基于感官評吸獲得了L8和L14最佳產(chǎn)香發(fā)酵條件。煙葉化學(xué)成分與致香成分分析表明，發(fā)酵后煙絲中主要化學(xué)成分比例更加協(xié)調(diào)，一些致香成分含量發(fā)生顯著改變，其中3-甲基丁醛可能轉(zhuǎn)變成更多乙酸，這些變化可能是L8和L14改善煙葉品質(zhì)的主要原因。

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