金毅然 馬斌武 孫文青 韓懷欽 何仲義 牛建國

目前腦缺血已成為臨床常見多基因疾病，其發(fā)病率、致殘率、病死率逐年提高?；虻膯魏塑账岫鄳B(tài)性(SNPs)是形成個體間差異的重要遺傳學基礎(chǔ)。怎樣從數(shù)百萬SNP中找到確有臨床意義的功能性SNP，是個體化醫(yī)學所面臨的重大挑戰(zhàn)[1]。

功能性的SNP可能影響基因的表達水平及蛋白的活性，進而影響其在機體細胞內(nèi)的功能[2]。解偶聯(lián)蛋白2(uncouple protein 2，UCP2)參與調(diào)控細胞內(nèi)過氧化物質(zhì)(ROS)的生成，其基因多態(tài)性(圖1)已經(jīng)被眾多研究者在不同人群中證實[3]。寧夏地區(qū)的回族人群中，腦缺血發(fā)病率在逐年升高。目前尚無UCP2基因多態(tài)性在回族人群中的分布資料。本研究以寧夏地區(qū)回族人群為研究對象，分析UCP2基因多態(tài)性在回族人群的分布特點及UCP2SNP與腦缺血發(fā)病風險的相關(guān)性。

圖1 UCP2基因多態(tài)性分布位點示意圖

1 對象與方法

1.1 研究對象

回族腦缺血患者診斷及正常對照組：腦缺血組71例，來自2014年1月-2015年10月在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院就診的寧夏地區(qū)回族住院患者，年齡50～65歲，均行顱腦CT和/或MRI檢查證實腦缺血，診斷依據(jù)中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南；對照組97例，為同期門診查體寧夏回族健康者，年齡50～65歲。所有研究對象均行生化項目檢查并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本基因組DNA提取 采集外周血，經(jīng)抗凝后采用QIANGEN minikit按試劑盒說明書進行基因組DNA提取，利用Nanodrop ND1000測定DNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA質(zhì)量，篩選優(yōu)質(zhì)DNA做后續(xù)實驗。

1.2.2 聚合酶鏈反應-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù) 采用Oligo7.0軟件設(shè)計引物。各位點引物序列為

UCP2-866G/A，上游引物 5’-CACGCTGCTTCTGCCAGG AC-3’；下游引物 5’-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。

Ala55Val(Exon4)，上游引物 5’-CTCCTCTTGGCTTAGATTCCTG-3’；下游引物 5’-GACAGAATCATACAGGCCGAT-3’。

Ins/Del(Exon8)，上游引物 5’-TGCCCTCCTTTCTCCGCTTG-3’；下游引物 5’-ATGGACCAGATGACCTACACG-3’。

采用常規(guī)PCR擴增包含相應位點的DNA片段。經(jīng)凝膠電鑒定擴增產(chǎn)物后經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，37 ℃ 4 h，將酶切產(chǎn)物電泳后采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)判斷基因分型。

1.2.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0分析軟件，檢驗水準設(shè)定為雙側(cè)P<0.05。定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，變異位點的基因型和等位基因頻率的組間差異分析采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組基本資料比較

正常對照組性別(男/女)比例為47/50，腦缺血組性別比例為37/34；正常對照組年齡(57.55±3.66)歲，腦缺血組年齡(58.68±3.86)歲；正常對照組體重(64.15±8.63)kg，腦缺血組體重(65.58±8.25)kg；2組在性別比例、年齡及體重等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)方面無明顯差異(P>0.05)。腦缺血組血清甘油三酯含量(1.62±0.58) mmol/L高于正常對照組(1.62±0.58) mmol/L(P<0.05)，但2組血清總膽固醇水平無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 腦缺血組及正常對照組基本資料比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05

2.2 UCP2-866G/A在寧夏地區(qū)回族正常人群、腦缺血患者分布特點及其與回族人群腦缺血的相關(guān)性

在回族正常人群中UCP2-866位點基因型GG、AA、GA的分布頻率分別為23.71%，24.74%，51.55%；在腦缺血患者中分布頻率分別為30.98%，21.13%，47.89%。2組頻率分布無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 回族正常人群及腦缺血患者UCP2-866G/A基因型分布特點[n(%)]

在回族正常人群中UCP2-866位點等位基因G、A的分布頻率分別為49.48%，50.52%；在腦缺血患者中分布頻率分別為54.93%，45.07%。2組等位基因型G、A的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 回族正常人群及腦缺血患者UCP2-866G/A等位基因分布特點[n(%)]

2.3 UCP2Ala55Val在寧夏地區(qū)回族正常人群及腦缺血患者分布特點及其與回族人群腦缺血的相關(guān)性

在回族正常人群中UCP2Ala55Val基因型Ala/Ala、Ala/Val、Val/Val的分布頻率分別為31.96%，49.48%，18.56%；在腦缺血患者中分布頻率分別為32.39%，46.48%，21.13%。2組分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表4)。

表4 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ala55Val基因型分布特點[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ala55Val等位基因C、T的分布頻率分別為56.70%，43.30%；在腦缺血患者中分布頻率分別為55.63%，44.37%。2組等位基因型C、T的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表5)。

表5 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ala55Val等位基因分布特點[n(%)]

2.4 UCP2Ins/Del在寧夏地區(qū)回族正常人群及腦缺血患者分布特點及其與回族人群腦缺血的相關(guān)性

在回族正常人群中UCP2Ins/Del位點基因型Del/Del、Ins/Del、Ins/Ins的分布頻率分別為49.5%，41.2%，9.3%；在腦缺血患者中分布頻率分別為47.9%，42.3%，9.8%。2組頻率分布無明顯差異(P>0.05)(表6)。

表6 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ins/Del基因型分布特點[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ins/Del等位基因Ins、Del的分布頻率分別為70.10%，29.90%；在腦缺血患者中分布頻率分別為69.01%，30.99%。2組等位基因型Ins、Del的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表7)。

表7 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ins/Del等位基因分布特點[n(%)]

3 討 論

研究者們對于基因的各種功能以及基因與疾病的發(fā)生和治療的關(guān)系等仍在進一步的探索中。人類的基因組序列存在個體差異，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應性等?；虻膯魏塑账岫鄳B(tài)性(SNPs)是形成個體間差異的重要遺傳學基礎(chǔ)，基于SNP分析的個體化醫(yī)療特點已經(jīng)基本確立[4]。

UCP2是線粒體陰離子轉(zhuǎn)運體蛋白家族中的一員，它存在于線粒體內(nèi)膜上。研究證明，UCP2參與調(diào)控細胞內(nèi)過氧化物質(zhì)(ROS)的生成[5]。Negre-Salvayre等用GDP抑制多種組織線粒體中UCP2的質(zhì)子轉(zhuǎn)運活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMP 增高，線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生也明顯增加[6]?；蚯贸男∈笠葝u細胞中的活性氧水平明顯升高[7]。腦缺血后細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多或清除能力減弱導致神經(jīng)細胞對缺血的易感性升高，將對機體產(chǎn)生嚴重損害。研究者證實，UCP2通過參與神經(jīng)元線粒體氧化磷酸化過程來降低神經(jīng)元ROS水平[3]。本課題組在以往研究中發(fā)現(xiàn),腦缺血后小鼠海馬神經(jīng)元DNA過氧化損傷與UCP2基因表達水平相關(guān)[8]。

功能性的SNP可能影響基因的表達水平及蛋白的活性，進而影響其在機體細胞內(nèi)的功能[9]。UCP2 基因的多態(tài)性已經(jīng)被眾多研究者在不同人群中證實。國內(nèi)學者曾經(jīng)分析了UCP2 基因的多態(tài)性在北京地區(qū)人群的分布特點[10]。UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del被證明在一些特定人群與糖尿病的發(fā)病風險密切相關(guān)[11]。以上3個位點的多態(tài)性直接影響UCP2基因表達水平及蛋白功能，影響細胞的能量代謝。雖然腦缺血的發(fā)病亦與機體細胞能量代謝水平紊亂相關(guān)，但是本研究結(jié)果表明UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del多態(tài)性與寧夏地區(qū)回族人群腦缺血發(fā)病無明顯相關(guān)性。

本研究首次以寧夏地區(qū)回族人群為研究對象，分析了UCP2 基因多態(tài)性在回族人群的分布特點及UCP2 SNP與腦缺血發(fā)病風險的相關(guān)性，為我區(qū)臨床防治回族人群腦缺血提供遺傳學資料。

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