屈文英

阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease，AD)和血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是老年期癡呆最主要的兩種疾病，近年來，隨著人口老齡化的不斷進(jìn)展，兩種疾病的患病人數(shù)呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)[1]。兩種疾病具體發(fā)病機(jī)制目前均尚不明確。就AD來說，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)瀑布理論是目前影響范圍最為廣泛的學(xué)說之一，該學(xué)說認(rèn)為Aβ生成和清除失衡是神經(jīng)元變性和癡呆發(fā)生的起始因素[2-3]。近年來，還有研究發(fā)現(xiàn)Aβ失衡可能與VD的發(fā)病和進(jìn)展也密切相關(guān)[4]。腦啡肽酶(Neprilysin，NEP)是一種位于細(xì)胞表面的Ⅱ型膜蛋白，可參與腦內(nèi)Aβ的降解[5]。有研究發(fā)現(xiàn)NEP與AD的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)，但目前關(guān)于NEP基因多態(tài)性與AD相關(guān)性的研究較少，且觀點(diǎn)不一[6-8]，探討NEP及其基因多態(tài)性與VD之間聯(lián)系的研究更為罕見。因此，本研究通過比較AD患者、VD患者和正常老年人NEP基因多態(tài)性，為癡呆的防治提供理論依據(jù)，為臨床提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年1月-2016年6月于本科門診或(和)住院治療的AD、VD患者納入AD組和VD組。AD組和VD組患者均需經(jīng)簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)及第4版美國(guó)精神醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)診斷為癡呆。AD組患者共138例，其中男56例，女82例，年齡64～81歲，平均年齡(75.4±8.5)歲，符合2011年美國(guó)神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和卒中老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS - ADRDA)很可能AD診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除由腦血管病、其他腦器質(zhì)性或功能性精神神經(jīng)疾病、嚴(yán)重全身性疾病引起的癡呆和假性癡呆，排除精神發(fā)育遲滯及老年人良性健忘癥。VD組患者共57例，其中男27例，女30例，年齡63～80歲，平均年齡(73.5±8.1)歲，其診斷及排除標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[9]。參照AD組和VD組性別及年齡構(gòu)成，從同期于本院體檢部體檢的無腦血管病病史且無認(rèn)知功能障礙的健康老年人中隨機(jī)選擇150例作為對(duì)照組，其中男70例，女80例，年齡63～80歲，平均年齡(73.7±9.2)歲。所有入組人員均為漢族，彼此無血緣關(guān)系。本研究通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有入組人員均充分知情同意。

1.2 基因多態(tài)性檢測(cè)

采集清晨空腹時(shí)外周靜脈血5 mL，按照氯仿飽和酚法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)聯(lián)合DNA直接測(cè)序法檢測(cè)NEP基因rs989692位點(diǎn)和rs6776185位點(diǎn)多態(tài)性。采用Primer5.0及Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行特性驗(yàn)證，引物由上海生共生物有限公司合成，其中rs989692位點(diǎn)上游引物：5’-CTCTGTGCCCCAGTTTCCTAAT-3’，下游引物：5’-TATCTTGCTCCAGTGGCTTCCT-3’； rs6776185位點(diǎn)上游引物：5’-CACAGAGCATTAGCAGCAGTTCCT-3’，下游引物：5’-ACAGCCCTTCTCCTGCACATAT-3’。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括10×Buffer 2.5μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，模板DNA1 μL，剩余由滅菌蒸餾水補(bǔ)足，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，然后按照95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s順序循環(huán)30周期，最后72 ℃延長(zhǎng)3 min，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定，對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，計(jì)量資料以±s表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析法評(píng)價(jià)各因素與缺血性腦卒中后繼發(fā)性癲癇的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組基本臨床特征比較

如表1，各組年齡、性別均無明顯差異(P均>0.05)；AD組和VD組比較，MMSE評(píng)分無明顯差異(P>0.05)；AD組和VD組MMSE評(píng)分與對(duì)照組比較均有明顯差異(P均<0.05)。

表1 各組基本臨床特征比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

如表2～3，各組NEP基因rs989692位點(diǎn)和rs6776185位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，其基因頻率已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

表2 NEP基因rs989692位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

表3 Nrf2基因rs6776185位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

2.3 基因型和等位基因分布頻率

如表4，各組NEP基因rs989692位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率均無明顯差異(P均>0.05)。對(duì)于rs6776185位點(diǎn)AD組和VD組分別與對(duì)照組比較，AA基因型和A等位基因分布頻率均明顯增多(P均<0.05)。AD組與VD組比較，2組基因型和等位基因分布頻率均無明顯差異(P均>0.05)。

3 討 論

有流行病學(xué)研究顯示年齡大于80歲老年人，約有20%患有癡呆。近年來，隨著生活和醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，我國(guó)乃至全世界逐步進(jìn)入老齡化社會(huì)，罹患癡呆的患者人數(shù)不斷增長(zhǎng)[1]，AD和VD作為癡呆最主要的兩種疾病，探索其遺傳易感性，對(duì)癡呆的防治均有重要意義。Aβ對(duì)神經(jīng)元和突觸具有毒性作用，可破壞突觸膜，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，在局部形成“老年斑”，Aβ腦內(nèi)沉積及“老年斑”形成是AD發(fā)病最重要的病理學(xué)特征之一。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)Aβ在腦血管病及VD的發(fā)病中也起到重要作用[2-4,10]。NEP作為體內(nèi)降解Aβ最重要的降解酶之一，近年來成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

NEP是一種含鋅離子的細(xì)胞表面Ⅱ型膜蛋白，屬于中性內(nèi)肽酶M13家族中的一員，早在1995年Howell等[11]學(xué)者便發(fā)現(xiàn)NEP可能參與Aβ的降解；隨后Iwata等[12]學(xué)者通過向?qū)嶒?yàn)大鼠海馬注射NEP選擇性抑制劑四氫噻吩證實(shí)了NEP對(duì)Aβ的降解作用。目前，越來越多的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)支持NEP與AD發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)，但NEP基因多態(tài)性與AD發(fā)病相關(guān)性的研究較少，且結(jié)論不一，缺乏大樣本的研究報(bào)道[6-8,13]。本研究在前期通過檢索中外相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)NEP基因多態(tài)性位點(diǎn)存在多個(gè)，包括rs989692C/T、rs6776185A/G、rs3736187A/G、rs1836915T/C、-204G/C、159C/T等[13-15]，但目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)可能與AD發(fā)病相關(guān)的位點(diǎn)不多，且少有研究取得重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果，甚至部分研究彼此矛盾，究其原因，筆者認(rèn)為可能包括以下幾點(diǎn)：①各研究AD診斷標(biāo)準(zhǔn)不一致，目前關(guān)于AD診斷多采用NINCDS - ADRDA制定的很可能AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)多以臨床癥狀為依據(jù)，本身特異性較差，容易導(dǎo)致選擇偏倚，且該標(biāo)準(zhǔn)不斷進(jìn)行更新，采用不同版本的診斷標(biāo)準(zhǔn)，必然導(dǎo)致各研究在患者選擇上即存在較大差別；②缺少大樣本量研究報(bào)道。一方面樣本量不足可能導(dǎo)致研究檢驗(yàn)效能降低，導(dǎo)致未出現(xiàn)陽性結(jié)果；另一方面不利于進(jìn)一步按照危險(xiǎn)因素進(jìn)行分層，探討NEP基因多態(tài)性的作用；③AD是一種多基因共同作用的疾病，探討單一位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)AD發(fā)病的影響，忽視了基因的相互作用，遺落了其他可能位點(diǎn)的功能；④可能不同種族使研究結(jié)果存在差異。NEP基因多態(tài)性與VD關(guān)聯(lián)性研究鮮有報(bào)道，多數(shù)研究通過證實(shí)NEP對(duì)Aβ具有降解作用，而Aβ參與VD發(fā)病，而間接推測(cè)NEP基因多態(tài)性與VD發(fā)病存在關(guān)聯(lián)[16-17]。

表4 NEP基因型和等位基因分布頻率

注：Ⅰ為AD組與VD組比較；Ⅱ?yàn)锳D組與對(duì)照組比較；Ⅲ為VD組與對(duì)照組比較

rs989692C/T和rs6776185A/G是目前研究較多的2個(gè)位點(diǎn)，但同樣國(guó)內(nèi)外報(bào)道的研究結(jié)果也不盡相同。本研究結(jié)果顯示3組患者rs989692位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)于rs6776185位點(diǎn)，AD組和VD組同對(duì)照組比較，AA基因型和A等位基因分布頻率均顯著增加，但(AA+AG)基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NEP基因rs6776185位點(diǎn)AA純合子基因型可能與AD及VD發(fā)病相關(guān)。本研究同時(shí)比較AD組和VD組患者rs6776185位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再次提示Aβ在兩種疾病發(fā)病中可能均扮演重要角色，NEP可通過降解Aβ干預(yù)AD、VD發(fā)病。

綜上所述，NEP基因rs6776185位點(diǎn)突變和AD及VD發(fā)病相關(guān)。然而，該研究也存在諸多不足之處，目前關(guān)于NEP基因多態(tài)性對(duì)AD、VD發(fā)作的確切作用機(jī)制和分子功能均未明確，需要進(jìn)一步從研究方法、研究對(duì)象選擇等方面做出更為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，完善研究結(jié)果。另外，NEP基因多態(tài)性與其他基因以及其他作用因素相互作用的具體機(jī)制也仍需進(jìn)一步研究。

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