龍根 蘇竹毅 謝敏杰 王偉 徐沙貝 劉晨辰

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的重要特征和基本過程，其運(yùn)行主要通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinases，Cdks)的蛋白激酶家族進(jìn)行調(diào)節(jié)[1]。其中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)作為Cdks家族的一員，是一種脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其氨基酸序列與Cdk2和細(xì)胞分裂周期激酶2(cdc2)有60%的同源性[2-3]。然而相比于其他細(xì)胞周期依賴性激酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的Cdk5并不直接參與細(xì)胞周期，并且需要與非細(xì)胞周期調(diào)節(jié)亞基蛋白 p35和p39以及它們的截短形式p25和p29結(jié)合才能產(chǎn)生活性[4]。Cdk5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生長發(fā)育調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞遷移、軸突生長、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性及認(rèn)知功能等方面發(fā)揮重要作用[5-7]，然而Cdk5在星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖過程中的作用尚不明確。本研究采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默Cdk5，觀察其對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，探討Cdk5在星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新生24 h內(nèi)的SPF級SD大鼠乳鼠，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。DMEM/F12、胎牛血清(美國Hyclone公司)，Opti-MEM(美國Gibco公司)，小鼠抗大鼠GFAP抗體(美國Neomarkers公司)，兔抗大鼠Cdk5抗體(美國Santa Cruz公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司)，Edu試劑盒(上海銳博公司)，Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，Cdk5引物及內(nèi)參(上海生工生物工程股份有限公司)。設(shè)計3種作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdk5的干擾序列為目的的siRNA分別為Si-r-Cdk5-001、Si-r-Cdk5-002及Si-r-Cdk5-003(表1)，由廣州銳博生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)和純化鑒定

取新生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠腦組織，PBS漂洗3遍，冰上小心去除腦膜及血管，取皮層組織置于無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，眼科剪剪碎，0.125%胰酶37℃消化2 min，用含15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中和胰酶，用200目篩網(wǎng)過濾，4℃ 800 r/min離心5 min，棄上清液，用含20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，種于用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后換液，除去死亡細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞，之后2～3 d換液，傳代2次后可用于實驗。

將星形膠質(zhì)細(xì)胞爬片，冰甲醇固定15 min，PBS漂洗3次，0.2% Triton X-100破膜15 min，PBS漂洗3次，5% BSA封閉1 h，PBS漂洗3次，小鼠抗大鼠GFAP抗體(1∶200)4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(1∶200)避光室溫下孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI染核8 min，PBS漂洗3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染

將星形膠質(zhì)細(xì)胞用0.25%胰酶消化，含15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中和胰酶，4℃ 800 r/min離心5 min，不含血清Opti-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于離心管中備用。用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamin 2000和siRNA，室溫置于EP管中5 min，將稀釋后的Lipofectamin 2000和siRNA輕柔混勻，室溫靜置20 min形成siRNA/Lipo 2000復(fù)合物，將復(fù)合物加入備好的含有星形膠質(zhì)細(xì)胞的離心管中，輕柔搖勻后靜置5 min，將細(xì)胞種入細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于36℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后改成含15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，利用轉(zhuǎn)染Cy3-siRNA的細(xì)胞來觀察轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)實驗需要，有3組siRNA序列可篩選，即Si-r-Cdk5-001(SiT1)組、Si-r-Cdk5-002(SiT2)組及Si-r-Cdk5-003(SiT3)組，分別加入SiT1/Lipo 2000復(fù)合物、SiT2/Lipo 2000復(fù)合物及SiT3/Lipo 2000復(fù)合物;同時設(shè)置空白對照組和陰性對照組，其中陰性對照組加入陰性對照siRNA，陰性對照siRNA與目的siRNA序列有相同的堿基組分，但排列不同;與Cdk5無同源性的序列用來排除轉(zhuǎn)入siRNA本身對細(xì)胞的影響。

1.2.3 RT-PCR

通過訪談和實驗，認(rèn)為語速緩慢，語音較高適合老年人的學(xué)習(xí)。但是這部分的課程只能是針對老年人開設(shè)的。如同上文所說，不能讓受眾面擴(kuò)大。

細(xì)胞總RNA提取按照Trizol說明書進(jìn)行，將溶解后的RNA取1 μL用DEPC水稀釋200倍后用紫外分光光度計測定OD260、OD280及OD260/OD280比值，計算RNA的純度及水平。將RNA在65℃條件下預(yù)變性5 min，42℃條件下60 min逆轉(zhuǎn)錄60 min，70℃條件下終止反應(yīng)5 min，合成cDNA。PCR擴(kuò)增引物序列為Cdk5，上游引物：5’-GGCACCTACGGAACTGTGTT-3’，下游引物：5’-CACAATCTCAGGGTCCAGGT-3’；GAPDH，上游引物：5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物：5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。PCR擴(kuò)增條件為95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 5s，30個循環(huán)。最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct法進(jìn)行分析。

表1 大鼠Cdk5 siRNA序列

1.2.4 Western Blot檢測

收集轉(zhuǎn)染72 h后的星形膠質(zhì)細(xì)胞，加裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白水平。取20 μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，250 mA、90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜，PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉液封閉90 min后小鼠抗大鼠Cdk5抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(1∶8000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL液顯色曝光，采用Gene Genius Bio-Imaging system凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳進(jìn)行采集和拍照，將拍照用軟件ImageJ對條帶的灰度信號(OD值)加以半定量分析。

1.2.5 Edu檢測細(xì)胞增殖

取已轉(zhuǎn)染Cdk5 siRNA的星形膠質(zhì)細(xì)胞及對照組細(xì)胞分別接種于24孔板，各個檢測時間點(diǎn)前2 h加入Edu，2 h后取出細(xì)胞，PBS漂洗3次，室溫下用冰甲醇固定細(xì)胞15 min，然后按照Edu試劑盒說明書進(jìn)行染色。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

取已轉(zhuǎn)染Cdk5 siRNA的星形膠質(zhì)細(xì)胞及對照組細(xì)胞置于0.1 mL PBS中，加入1 mL 80%的冰乙醇后放入-20℃，檢測前用PBS漂洗冰乙醇2次，用終濃度為50 μL/mL的PI染液4℃避光染色過夜，用流式細(xì)胞儀檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期變化。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

SD大鼠乳鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)得到純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，呈不規(guī)則形，邊界清晰，胞體豐滿扁平，細(xì)胞間彼此連接，折光性強(qiáng)，將星形膠質(zhì)細(xì)胞行GFAP免疫熒光染色，證明原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞98%表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP(圖1)。

圖1 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 其中綠色為GFAP陽性,藍(lán)色為細(xì)胞核DAPI染色

2.2 Cdk5-siRNA轉(zhuǎn)染效率及沉默效率

星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cy3-siRNA，培養(yǎng)后熒光染色可見Cy3標(biāo)記的siRNA包繞在細(xì)胞核周圍，提示成功轉(zhuǎn)染入星形膠質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85%以上。利用RT-PCR和Western blot分別測定Cdk5 mRNA及蛋白表達(dá)水平來篩選最有效沉默星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdk5的siRNA。其中RT-PCR顯示與空白對照組比較， SiT1組、SiT2組及SiT3組的Cdk5 mRNA表達(dá)水平都降低(P<0.01)，其中SiT3轉(zhuǎn)染后的Cdk5 mRNA表達(dá)水平最低(圖2)。Western blot顯示與空白對照組比較，SiT1、SiT2及SiT3轉(zhuǎn)染后的Cdk5蛋白水平均降低(P<0.01)，其中SiT3組的Cdk5 蛋白表達(dá)水平最低(圖2)，這與RT-PCR一致。因此，后續(xù)實驗選取SiT3作為Cdk5 siRNA對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

圖2 不同Cdk5-siRNA對Cdk5表達(dá)水平的影響 其中A為RT-PCR,SiT3組的Cdk5mRNA表達(dá)水平最低,與陰性對照組比較,*P<0.01;B為Westernblot,SiT3組的Cdk5蛋白表達(dá)水平最低,與陰性對照組比較,*P<0.01

2.3 Edu檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖

Edu陽性反應(yīng)位于胞核內(nèi)，Edu檢測顯示Cdk5 siRNA干預(yù)組3、6、12 h Edu染色陽性率較對照組顯著降低(P<0.01)，24 h Cdk5 siRNA干預(yù)組與對照組的比較無明顯差異(P>0.05)(圖3)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期變化

流式細(xì)胞術(shù)對星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期分析顯示Cdk5 siRNA干預(yù)組3、6、12 h處于S期的星形膠質(zhì)細(xì)胞比例較對照組顯著降低(P<0.05)，24 h 2組S期細(xì)胞比例無明顯差異(P>0.05)(圖4)。

3 討 論

細(xì)胞周期在真核細(xì)胞的生長、分化及增殖過程中起到?jīng)Q定性作用。通常細(xì)胞在細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的精密調(diào)控下可以完美地完成整個細(xì)胞周期過程，然而一旦出現(xiàn)任何異常調(diào)節(jié)的情況均可導(dǎo)致細(xì)胞功能的異常，甚至細(xì)胞死亡。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的兩類細(xì)胞，以往普遍認(rèn)為成熟的神經(jīng)元屬于終末分化細(xì)胞，不具備增殖能力，但最新研究顯示神經(jīng)元受到損傷時可出現(xiàn)細(xì)胞周期的重激活，神經(jīng)元可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，但是細(xì)胞周期激活后的神經(jīng)元并不能完成整個細(xì)胞周期，最終會走向死亡[8-9]。相反，膠質(zhì)細(xì)胞不同于神經(jīng)元，它本身即具備增殖的能力，受損的膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)生過度激活，從而致使膠質(zhì)疤痕的形成以及炎性因子大量釋放[10]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最多的細(xì)胞，在正常狀態(tài)下可以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、清除氧自由基、減輕神經(jīng)興奮性毒性、介導(dǎo)血管形成、營養(yǎng)神經(jīng)再生等。在神經(jīng)系統(tǒng)受損后(包括缺血、損傷等)星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞肥大、活化增殖等現(xiàn)象。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞雖然在一定程度上能夠保護(hù)周圍受損的神經(jīng)元，但過度的活化增殖可直接介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡以及膠質(zhì)疤痕的形成，從而造成更進(jìn)一步的損傷[11]。雖然損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖的具體機(jī)制目前仍不清楚，但前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受損后細(xì)胞周期重激活及細(xì)胞周期的調(diào)控在其中起到關(guān)鍵性作用[12-13]。

圖3 Edu染色觀察Cdk5siRNA干預(yù)對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 其中A為干預(yù)12h2組星形膠質(zhì)細(xì)胞的Edu染色;B為干預(yù)后不同時間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞Edu染色陽性細(xì)胞率,與對照組比較,*P<0.01

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析Cdk5siRNA干預(yù)對星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 其中A為干預(yù)12h2組星形膠質(zhì)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測;B為干預(yù)后不同時間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞處于S期細(xì)胞比例,與對照組比較,#P<0.05

參與細(xì)胞周期調(diào)控過程主要包括細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (Cyclin dependent kinases,Cdks)和Cdks抑制蛋白(Cyclin dependent kinases inhibitors，CdkIs)[12]。其中Cdks發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(Cyclin-dependent kinases 5，Cdk5)是Cdks家族中的一員。Cdk5被認(rèn)為是“標(biāo)新立異”的Cdks成員，它并不直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，它可以和CyclinD1和D2結(jié)合，但并不產(chǎn)生激酶活性，與調(diào)節(jié)因子p35或p39結(jié)合后產(chǎn)生活性[4]。其中p35主要在大腦皮質(zhì)中起作用，而p39更多出現(xiàn)在小腦[14]。通常來講，Cdk5的活性在活體內(nèi)被有序的調(diào)控，包括p35和Cdk5基因的轉(zhuǎn)錄控制、p35的降解、p35和Cdk5的磷酸化和結(jié)合以及p35到p25的轉(zhuǎn)變等[15]。

早期研究證明CDK5在神經(jīng)元中存在表達(dá)，且在神經(jīng)元的正常生理功能中起關(guān)鍵作用。有研究顯示CDK5/p35復(fù)合體穩(wěn)定可以維持神經(jīng)元的存活，但同時也證實在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中CDK5的過度激活可以介導(dǎo)一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[16-18]。此外，Zhang 等[17,19]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)受損后神經(jīng)元細(xì)胞周期重激活導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和CDK5胞漿胞核的表達(dá)變化密切相關(guān)。由此可見CDK5在神經(jīng)元各個過程中均起到重要作用。然而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中關(guān)于Cdk5的研究很少。

目前Cdk5抑制劑(例如roscovitine，olomoucine或者butyrolactone-1)被頻繁使用，但最主要的問題是這些抑制劑對其他Cdks也都有抑制作用[20-22]。因此，特異性沉默星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdk5顯得尤為重要。RNA干擾是近年來發(fā)展的新技術(shù)，利用小的雙鏈RNA特異性降解與其同源的mRNA來阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)[23]。本研究利用RNA干擾技術(shù)特異性沉默星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdk5后Edu檢測結(jié)果顯示RNA干擾沉默Cdk5組Edu染色陽性率較對照組降低，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與Edu檢測結(jié)果一致，RNA干擾沉默Cdk5組的S期細(xì)胞率較對照組減少。將Edu染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)合起來能更加準(zhǔn)確反映DNA合成的S期。本研究結(jié)果顯示特異性沉默Cdk5可顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展，可以推測Cdk5對星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖可能起正向調(diào)控作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示沉默Cdk5可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展，通過對Cdk5的干預(yù)可能起到抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化增殖的目的，可為進(jìn)一步研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化增殖機(jī)制和調(diào)控提供實驗依據(jù)。

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