閆曉娟，翟華強(qiáng)，魯曉光

(1.廊坊市廣陽區(qū)婦幼保健院，廊坊 065000； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；3.南陽市食品藥品檢驗所，南陽 473061)

十三味青蘭散系藏藥常用方劑，主要由甘青青蘭、木香、余甘子、石榴子、巴夏嘎、矮紫堇、酸藤果、豆蔻、蓽茇、干姜和芫荽果等13味藥組成，理氣健胃，消炎止痛，用于治療“培根木布”病引起的急慢性胃炎、潰瘍性胃炎、萎縮性胃炎、十二指腸潰瘍、膽汁反流性胃炎、胃絞痛、腹脹、胃痛、腹痛、胃酸、嘔吐和食積不化等癥，其生理功能為運化食物、調(diào)節(jié)水液等。關(guān)于十三味青蘭散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要為《衛(wèi)生部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)》(第一冊)[1]，其標(biāo)準(zhǔn)只有性狀、項目檢查，且無關(guān)于十三味青蘭散的文獻(xiàn)報道，為了更好的對藏藥十三味青蘭散進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控[2]，本文選擇其處方中用量最多的木香和具有溫中散寒、下氣止痛功效的蓽茇進(jìn)行質(zhì)量控制，建立了能同時測定十三味青蘭散中木香、蓽茇的活性成分木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯[3-15]和胡椒堿[16-18]含量的方法，結(jié)果表明，本方法操作簡便、重復(fù)性好，可有效控制藏藥十三味青蘭散的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695高效色譜系統(tǒng)-2996 PDA檢測器(沃特世科技公司)；KQ2200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；西特電子天平BL-310A(美國Setra公司)。

1.2試藥 胡椒堿(批號110775-21104)、木香烴內(nèi)酯(批號111524-201509)、去氫木香內(nèi)酯(批號111525-201510)，均購自中國食品藥品檢定研究院；十三味青蘭散(批號：160901，160902，160903)，北京中醫(yī)藥大學(xué)自制；甲醇為色譜純(美國天地有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性 Welchrom Materials C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水(65∶35)為流動相；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；紫外檢測波長：205 nm，運行時間為30 min，進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按照木香烴內(nèi)酯計算應(yīng)不低于5 000。在上述條件下，胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的色譜峰，峰形基本對稱，各色譜峰左右無干擾，陰性樣品溶液對測定無干擾。見圖1。

2.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品各10.43，16.21和24.67 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為1.031 7，1.604 8和2.459 6 mg·mL-1的系列對照品儲備液，再精密吸取各儲備液2 mL，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.103 5，0.160 5和0.246 mg·mL-1混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取供試品粉末1 g，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4陰性樣品溶液的制備 按照十三味青蘭散處方制得不含蓽茇和木香的樣品，按照2.3項下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

圖1HPLC圖

A.混合對照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.胡椒堿； 2.木香烴內(nèi)酯； 3.去氫木香內(nèi)酯。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.piperine；2.costunolide；3.dehydrocostus lactone.

2.5線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項下制備的混合對照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μL，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析。以組分質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯回歸方程分別為：y=27 625 931x-113 769 (r=0.999 3)，y=22 474 980x-156 285(r=0.999 9)，y=29 420 624x-383 634(r=0.999 6)；其進(jìn)樣質(zhì)量分別在0.010 4～0.206 9，0.016～0.321和0.024 6～0.491 9 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度實驗 精密吸取2.2項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積及保留時間，計算胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積RSD值，其保留時間RSD值分別為0.07%，0.18%和0.08%，其峰面積RSD值分別為1.27%，0.70%和1.40%，結(jié)果表明，保留時間及峰面積精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一份供試品溶液，分別按照2.1項下色譜條件，在0，2，4，6，8，12和24 h重復(fù)進(jìn)樣，記錄胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積，計算RSD值分別為0.71%，1.08%和0.85%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性實驗 取同一批號樣品，按照2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣，測得胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積，計算RSD值分別為1.29%，1.55%和1.02%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率實驗 精密稱取已知樣品(批號160901)6份，每份0.5 g。置于具塞錐形瓶中，每2份樣品中分別精密加入混有一定量的混合對照品溶液(精密量取2.2項下制備的混合對照品溶液1，2和3 mL，分別置于50 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻)25 mL，按照2.3項下方法制備供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件分別測定。計算平均回收率，結(jié)果見表1。

2.10樣品含量測定 精密稱取3批樣品(批號：160901，160902，160903)，按照2.3項下制備供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣。以外標(biāo)法(峰面積)進(jìn)行計算，結(jié)果表明，3批藏藥十三味青蘭散含胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯分別為2.12，3.50和5.47 mg·g-1；1.78，3.18和5.05 mg·g-1；1.87，3.21和5.08 mg·g-1。

3 討論

3.1檢測波長的選擇 通過PAD檢測器在紫外光波范圍掃描得知，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的最大吸收峰波長為203 nm，胡椒堿的最大吸收波長在345 nm，但其次高峰在202 nm處，綜合考慮，選擇波長203 nm作為檢測波長。

3.2流動相的選擇 通過比較乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)，比較各系統(tǒng)不同比例發(fā)現(xiàn)：甲醇-水(65∶35)對各組分可以達(dá)到很好的分離效果，且操作簡單，因此選擇其作為該實驗流動相系統(tǒng)。

3.3供試品溶液的制備方法 本實驗經(jīng)查詢相關(guān)資料，選定甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷3種溶液，超聲和回流2種方式，10，20，30，40，50和60 min 6個時間段，通過實驗比較：采用甲醇溶液提取含量最高，超聲比回流提取含量要高，而提取時間在40 min后含量提高不是太明顯，綜上考慮，選擇最簡單的甲醇溶液超聲40 min作為供試品溶液的制備方法。

3.4小結(jié) 藏藥十三味青蘭散作為用于治療 “培根木布”病引起的胃腸潰瘍絞痛、脘腹脹痛和急慢性胃炎的常用藥物，長期以來其簡單的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不利于民族藥的發(fā)展，為了促進(jìn)藏藥的發(fā)展，本文特針對處方中用量最多的木香和具有溫中散寒、下氣止痛功效的蓽茇進(jìn)行質(zhì)量控制，建立了同時測定十三味青蘭散中的木香、蓽茇活性成分胡椒堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量的方法，該方法操作簡單、方便，可為今后藏藥十三味青蘭散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[19-20]的提高提供參考。

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