洪 慧，梁文忠

(1.上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析服務部，上海 200131)

近年來伴隨高脂血癥、肥胖癥、糖尿病和高血壓等疾病的高發(fā)，導致高尿酸血癥及痛風的發(fā)病率在全球范圍內呈逐年上升的趨勢[1-10]。目前，我國臨床主要采用苯溴馬隆等西藥治療原發(fā)性和繼發(fā)性高尿酸血癥，以及各種原因引起的痛風。苯溴馬隆為苯并呋喃衍生物，屬于β受體阻滯劑，能抑制腎小管對尿酸的重吸收，促進尿酸排泄，是良好的嘌呤氧化酶抑制劑，具有抑制尿酸生成的作用，對降低血中尿酸質量濃度達到雙重效果[11-16]。

根據(jù)目前發(fā)表的國內外文獻報道，現(xiàn)有的定量測定血漿中苯溴馬隆的方法有HPLC法[17-20]和GC-MS法[21]，采用LC-MS法[22]只是定性分析其代謝產物，尚未見文獻中報道采用液質聯(lián)用方法來定量分析血漿中苯溴馬隆的質量濃度。本文首次建立用LC-MS/MS法測定人血漿中苯溴馬隆的質量濃度，具有簡單穩(wěn)定、快速、特異性高等特點，可同時滿足臨床藥代動力學研究及生物等效性研究中大批量樣品快速分析的要求。

1 儀器與試藥

1.1儀器 API6500型三重四極桿質譜儀(美國Sciex公司)，配有大氣壓化學電離源(APCI)及Analyst 1.6.3分析軟件；Nexera UHPLC超高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有自動進樣器及柱溫箱等。

1.2試藥 苯溴馬隆標準對照品(加拿大TRC公司，批號2-BLH-83-1，質量分數(shù)98.0%)；苯溴馬隆EP Impurity B對照品(加拿大TLC公司，批號2441-002A3，質量分數(shù)99.5%)；色譜純級甲醇、乙腈(美國Merck公司)；醋酸銨(加拿大Fluka公司)；甲酸(美國Sigma-Aldrich公司)；去離子純水由實驗室ELGA純凈水發(fā)生器制備。

2 方法

2.1液相色譜-質譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為分別含1 mL·L-1甲酸的2 mmol·L-1醋酸銨的水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序為[0 min，A∶B(45∶55)→1.6 min，A∶B(5∶95)→2.0 min，A∶B(5∶95)→2.01 min，A∶B(45∶55)→2.5 min，A∶B(45∶55)]；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：60 ℃；進樣量為3 μL。

2.1.2質譜條件 離子源為大氣壓化學電離源(APCI)，負離子模式檢測；掃描方法為多反應監(jiān)測(MRM)；苯溴馬隆和苯溴馬隆EP Impurity B的檢測離子對分別是m/z422.7→250.8和m/z502.6→250.9，去簇電壓(DP)分別為-45 V和-80 V，碰撞能(CE)分別為-42 V和-50 V，霧化電流為-3 mA；離子源溫度為450 ℃；氣簾氣流速為40 psi，噴霧氣流速為50 psi，各離子通道掃描時間為100 ms，相應的二級質譜圖見圖1。

圖1二級質譜掃描圖

A.苯溴馬??；B.苯溴馬隆EP Impurity B。

Fig.1 Product Ion spectra

A.benzbromarone；B.benzbromarone EP Impurity B.

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 精密稱取苯溴馬隆標準對照品適量，置于4 mL棕色玻璃瓶中，加入二甲亞砜(DMSO)溶解至質量濃度為1 mg·mL-1的對照品儲備液。將上述儲備液用乙腈-水(7∶3)溶液按照梯度稀釋成質量濃度為1 000，2 000，5 000，10 000，20 000，100 000，180 000和200 000 ng·mL-1的系列對照品溶液，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.2內標溶液 精密稱取苯溴馬隆 EP Impurity B對照品適量，置于4 mL棕色玻璃瓶中，加DMSO溶解至質量濃度為1 mg·mL-1的內標儲備液。將上述內標儲備液用乙腈-水(7∶3)溶液稀釋至質量濃度為8 000 ng·mL-1，即得，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.3樣品前處理 精密移取血漿50 μL，置于96孔板中，加入20 μL內標溶液，置于搖板機中混勻2 min，加入330 μL乙腈沉淀，搖勻10 min，于4 ℃條件下，以4 000 r·min-1離心15 min。取上清液100 μL，移至另一塊96孔板中，加入200 μL乙腈-水溶液(1∶1)稀釋，搖勻。取3 μL進樣檢測。

2.3專屬性考察及干擾考察 本實驗采用的質譜和色譜條件下，人空白血漿，空白血漿+苯溴馬隆以及空白血漿+苯溴馬隆+苯溴馬隆EP Impurity B的色譜圖見圖2。由圖2可知，空白基質中的內源性物質對待測物無干擾；內標對待測物不存在干擾，只存在串擾(crosstalk)現(xiàn)象，在色譜上兩者有明顯的分離，不影響待測物分析；作為內標的化合物是待測藥物工藝合成過程中產生的雜質，因此待測物最高定量上限(ULOQ)對內標通道信號有一定貢獻，通過適當調整加入的內標質量濃度，使其干擾峰面積遠小于5%的內標峰面積平均值，可滿足生物樣品分析方法指導原則的要求。

2.4標準曲線與線性范圍 分別精密吸取系列對照品溶液20 μL，加入380 μL的空白血漿中，渦旋混勻，配制得到質量濃度為50，100，250，500，1 000，5 000，9 000和10 000 ng·mL-1的血漿樣品，按照血漿樣品預處理方法進行操作，以不同質量濃度對照品樣品測得的苯溴馬隆與內標峰面積比值為縱坐標(y)、苯溴馬隆質量濃度為橫坐標(x)，用加權最小二乘法進行線性回歸，方程為y=0.000 35x+0.000 63(r=0.999)。苯溴馬隆線性范圍：50～10 000 ng·mL-1，方法定量下限為50 ng·mL-1。

圖2HPLC圖

A.空白血漿；B.空白血漿+苯溴馬隆(10 000 ng·mL-1)；C.空白血漿+苯溴馬隆(50 ng·mL-1)+苯溴馬隆EP Impurity B；(左：苯溴馬隆；右：苯溴馬隆EP Impurity B)。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.blank plasma；B.blank plasma+benzbromarone(10 000 ng·mL-1)；C.blank plasma + benzbromarone (50 ng·mL-1)+ benzbromarone EP Impurity B；(Left：benzbromarone；Right:benzbromarone EP Impurity B).

2.5方法精密度和準確度 按照苯溴馬隆標準曲線制備方法制備質控樣品，對定量下限(LLOQ)和低、中和高4個質量濃度(分別為50，150，4 000和8 000 ng·mL-1)樣品進行了連續(xù)3 d的6份樣品分析。以同一批次的2條隨行標準曲線計算實測質控樣品的質量濃度，評價方法的批內、批間精密度，其RSD值均小于5%,結果表明，精密度和準確度良好，符合接受標準。

2.6絕對回收率和基質效應 按照苯溴馬隆標準曲線制備方法制備低、中和高3個質量濃度的質控樣品，按照血樣預處理后進樣分析，記錄藥物峰面積。與相同質量濃度的空白基質提取后添加待測物的樣品進樣得到的峰面積進行比較，計算苯溴馬隆提取回收率(n=6)，3個質量濃度的質控樣品回收率分別是102%±5.08%，103%±3.09%和100%±3.96%，其RSD值均小于4%。

提取6個不同批次的單人空白血漿即得空白基質樣品。向空白基質樣品中添加待測物和內標溶液，使其最終質量濃度與進樣時的低、中和高3種質量濃度一致，各質量濃度平行3份。同時配制含有待測物和內標溶液的參比溶液，同樣配制低、中和高3種質量濃度。比較空白基質樣品和參比溶液中待測物和內標的峰面積，計算得到苯溴馬隆的3種質量濃度基質效應因子分別是97.8%±3.49%，98.6%±1.43%和100%±1.93%，其RSD值均小于4%。

結果表明，內標的提取回收率在3種質量濃度的質控樣品中保持一致，且無基質效應。同時考察溶血和含高脂血的血漿樣品的基質效應，均符合分析接受標準。

2.7穩(wěn)定性考察 考察標準血漿樣品在各條件下的穩(wěn)定性，按照2.2.3項下方法對血漿進行前處理后，測定其主峰與內標峰面積的比值，根據(jù)RSD值及準確度進行判斷。不同條件下各質量濃度平行取3份，分別于室溫放置4和24 h以及4 ℃冰箱中放置24 h，結果表明，苯溴馬隆的質量濃度無改變，常規(guī)穩(wěn)定性良好；分別置于-20與-80 ℃冰箱中，反復融凍3次，結果表明，苯溴馬隆的質量濃度保持穩(wěn)定，凍融穩(wěn)定性良好；分別置于-20與-80 ℃冰箱保存55 d，結果表明，苯溴馬隆各質量濃度均未發(fā)生改變，長期穩(wěn)定性良好。另外，還考察了對照品溶液的室溫穩(wěn)定性，結果表明，室溫條件下放置54 h穩(wěn)定。

2.8生物等效性研究中的應用 出于與客戶間保密協(xié)議的考慮，不便公開發(fā)表藥代動力學參數(shù)相關數(shù)據(jù)。這里僅展示實際樣品分析階段中某健康受試者口服苯溴馬隆片后1 h的色譜分析圖，見圖3。

圖3實際樣品HPLC圖

A.苯溴馬??；B.苯溴馬隆EP Impurity B。

Fig.3 HPLC chromatograms of incurred sample

A.benzbromarone；B.benzbromarone EP Impurity B.

3 討論

苯溴馬隆EP Impurity B與苯溴馬隆結構極其類似，只相差1個-Br基團，二者在質譜內裂解位點相同，具有部分相同的碎片離子峰。筆者選擇了質譜響應最強的250.8作為子離子監(jiān)測。苯溴馬隆極性較小，易溶于有機試劑，因此文獻中的前處理大多采用有機溶劑提取法[21]，但前處理所需時間較長且操作繁瑣。本實驗采用簡單的蛋白沉淀法，用乙腈對血漿樣品進行蛋白沉淀，方法簡便、經濟、回收率高。質譜采用APCI離子源[23]，有效地消除了待測物的基質效應。同時采用了亞2微米色譜柱，提高柱溫至60 ℃，極大地提高了色譜分離度，縮短了分析時間[24]。

在沒有商業(yè)化的同位素標記內標出售的前提下，經過評估，最終選擇了與苯溴馬隆結構相似的苯溴馬隆EP Impurity B作為內標化合物。雖然它屬于待測物對照品中的1種雜質，但由于其含量極低，對待測藥物的分析無干擾，且具有與待測藥物較接近的保留時間，相近的提取回收率(大于93%)和基質效應(98.5%～100.6%)，是一個適合的內標。購買商品化對照品經濟便宜，無需花費時間和更高成本去合成同位素內標。

本研究首次建立一種高效的LC-MS/MS法測定人血漿中苯溴馬隆的質量濃度，并成功應用于生物等效性樣品分析。此方法簡單穩(wěn)定，分析速度快，分析效率明顯優(yōu)于目前已有的文獻報道[17-21]，可滿足臨床藥代動力學研究及生物等效性研究中大批量樣品快速分析的要求。

參考文獻：

[1] 藤森新.高尿酸血癥[J].日本醫(yī)學介紹，2001，22(7):307-309.

[2] 詹益淵，林堅.高尿酸血癥[J].實用醫(yī)學雜志，1992，8(1):24-26.

[3] 邱朝暉，曹奕，鄭安琳，等.高尿酸血癥與高血壓的關系[J].國外醫(yī)學心血管疾病分冊，2001，28(1):9-11.

[4] 陳光亮，徐叔云.高尿酸血癥研究進展[J].中國藥理學通報，2003，19(10):1088-1092.

[5] 苗志敏，趙世華，王顏剛，等.山東沿海居民高尿酸血癥及痛風的流行病學調查[J].中華內分泌代謝雜志，2006，22(5):421-425.

[6] 邵繼紅，徐耀初，莫寶慶，等.痛風與高尿酸血癥的流行病學研究進展[J].疾病控制雜志，2004，8(2):152-154.

[7] 朱君，余俊文.高尿酸血癥和痛風的流行病學及其危險因素的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8(1):191-195.

[8] 方順源，朱曉霞，金達豐，等.高血壓與肥胖、高血脂、高血糖及高尿酸血癥的關系[J].中國慢性病預防與控制，2006，14(1):33-35.

[9] 王超英，何金紅.高尿酸血癥與高血壓、肥胖、高血脂、糖尿病的關系分析[J].實用醫(yī)學雜志，2010，26(5):819-821.

[10]臧路平，劉志剛，吳新榮.高尿酸血癥發(fā)病機制及其藥物治療研究進展[J].醫(yī)藥導報，2011，30(1):69-73.

[11]安雅婷，楊培樹，王雅琦，等.高尿酸血癥發(fā)病機制及藥物治療[J].天津藥學，2015，27(5):72-75.

[12]勞志英.原發(fā)性痛風關節(jié)炎的診斷和藥物治療[J].中國新藥與臨床雜志，2004，23(9):632-634.

[13]宋艷玲.苯溴馬隆治療高尿酸血癥和痛風的療效觀察[J].中國醫(yī)藥導刊，2014，16(5):858-859.

[14]曹雪霞，王立.國產苯溴馬隆治療2型糖尿病合并高尿酸血癥的療效與安全性[J].中國新藥雜志，2006，15(4):301-303.

[15]韓文娟，錢培玲，顧詠亮，等.苯溴馬隆與別嘌醇治療高尿酸血癥臨床效果對照[J].上海醫(yī)藥，2004，25(10):468-469.

[16]倪坤儀，于清峰，郁建，等.苯溴馬隆及其雜質的質量研究[J].分析化學研究簡報，2002，30(5):564-567.

[17]余勤，梁茂植，秦永平，等.反相離子對HPLC法測定人血漿中苯溴馬隆的濃度[J].華西藥學雜志，2004，19(3):183-185.

[18]熊磊，蘇丹，吳笑春，等.HPLC法測定人血漿中苯溴馬隆濃度[J].中國藥師，2007，10(5):456-457.

[19]劉蔚，楊永健.苯溴馬隆片的HPLC測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33(1):30-31.

[20]譚力，王穎，李江利，等.高效液相色譜法測定苯溴馬隆血藥濃度及生物等效性研究[J].中國臨床藥理學雜志，2001，17(3):211-214.

[21]De Vries J X，Walter-Sack I，Ittensohn A.Analysis of benzbromarone in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr，1987，417:420-427.

[22]Arnold P J，Guserle R，Luckow V，et al.Liquid chromatography-mass spectrometry in metabolic research：I.Metabolites of benzbromarone in human plasma and urine[J].J Chromatogr，1991，554:267-280.

[23]Chambers E，Wagrowski-Diehl D M，Lu Z，et al.Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses[J].J Chromatogr B，2007，852:22-34.

[24]杜聞杉，劉沛，劉翠哲.超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術在藥代動力學研究中的應用[J].承德醫(yī)學院學報，2015，32(5)：425-427.