王韋江，王園園，范金鵬

周?chē)窠?jīng)損傷是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病[1]，其所帶來(lái)的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與日聚增，而且神經(jīng)修復(fù)后功能恢復(fù)和再生仍是困擾臨床的復(fù)雜問(wèn)題。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）具有促進(jìn)神經(jīng)再生、修復(fù)的作用[2]，被廣泛應(yīng)用于臨床。目前NGF多采用全身給藥，很難達(dá)到局部有效藥物濃度。本課題在以往的研究中證實(shí)，局部持續(xù)灌注NGF對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)具有更加理想的作用，但灌注劑量仍缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)。為進(jìn)一步探討灌注不同劑量NGF對(duì)神經(jīng)修復(fù)的影響，特進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，200～220 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。隨機(jī)分為3組，每組10只，單籠普通喂養(yǎng)。

1.1.2 試劑與設(shè)備 注射用鼠NGF（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠(chǎng)）；JZB-1800單道注射泵（長(zhǎng)沙健源醫(yī)療科技有限公司），Medtronic Keypoint肌電誘發(fā)電位儀（9031A070，丹麥）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 手術(shù)方法 大鼠腹腔內(nèi)注射0.1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，固定大鼠于操作平臺(tái)上，于大鼠左側(cè)股后部縱行切口，顯露分離坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣約1.5cm處切斷坐骨神經(jīng)，采用10-0無(wú)創(chuàng)尼龍線(xiàn)做神經(jīng)外膜間斷縫合，保持適當(dāng)張力。制作神經(jīng)吻合口包埋鞘：選用內(nèi)徑1.5 mm、外徑2 mm的醫(yī)用T形硅膠管 （深圳市泰華硅膠制品有限公司），修剪為T(mén)形橫端長(zhǎng)1 cm，縱端長(zhǎng)1.5 cm。將T形硅膠管橫端在神經(jīng)吻合前套入神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)斷端，神經(jīng)斷端吻合后將T形硅膠管平穩(wěn)移至吻合口處，遠(yuǎn)近端距離相等，T形硅膠管遠(yuǎn)近端分別與相鄰神經(jīng)外膜縫合3針固定，T形硅膠管縱端末尾縫合固定于皮下組織，縱端末尾與持續(xù)灌注系統(tǒng)相連。

1.2.2 鞘內(nèi)灌注 所有動(dòng)物均于術(shù)后立即開(kāi)始灌注NGF，使用生理鹽水及NGF配制灌注液，A組灌注濃度為15 μg/2 ml，灌注速度0.1 ml/h；B組和C組灌注濃度分別為 30 μg/2 ml和 60 μg/2 ml， 灌注速度與A組相同。3組灌注時(shí)間均為3 w。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)物行為變化 術(shù)后3 w內(nèi)，觀(guān)察大鼠術(shù)側(cè)后肢及足趾的運(yùn)動(dòng)情況，潰瘍廣度、深度及潰瘍愈合情況，足趾搔趴試驗(yàn)、展爪試驗(yàn)等。

1.3.2 神經(jīng)電生理檢查 于術(shù)后3 w，每組隨機(jī)取5只大鼠行神經(jīng)電生理檢查：暴露術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)吻合口及遠(yuǎn)近端，電極刺激吻合口遠(yuǎn)近端神經(jīng)，使用Medtronic Keypoint肌電誘發(fā)電位儀(9031A070，丹麥)記錄兩點(diǎn)間潛伏期，依據(jù)兩點(diǎn)間距離計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.3.3 吻合口大體觀(guān)察和鏡下觀(guān)察 電生理檢查完畢后，處死大鼠，觀(guān)察吻合口大體情況，并制作切片進(jìn)行光鏡觀(guān)察。鏡下觀(guān)察瘢痕組織增生、髓鞘細(xì)胞數(shù)量、軸突數(shù)量及直徑等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀(guān)察 所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后均立即出現(xiàn)術(shù)側(cè)足下垂，足趾屈曲、足背著地，后肢運(yùn)動(dòng)受限明顯。大鼠術(shù)側(cè)后肢均于術(shù)后1 w開(kāi)始出現(xiàn)足背脫毛、紅腫，遠(yuǎn)端皮膚潰瘍、糜爛，并逐漸擴(kuò)大、加深；約2 w時(shí)，足部創(chuàng)面逐漸停止擴(kuò)大，基底出現(xiàn)少量肉芽組織；3 w后創(chuàng)面基本愈合，術(shù)肢步態(tài)有所恢復(fù)。3組在出現(xiàn)潰瘍時(shí)間、潰瘍深度、面積及潰瘍愈合時(shí)間等方面無(wú)明顯差異。

2.2 吻合口大體觀(guān)察 術(shù)后3 w各組神經(jīng)吻合口愈合良好，各組間吻合口大體觀(guān)察未見(jiàn)明顯差異。

2.3 電生理學(xué)檢查 3組間比較，C組神經(jīng)傳導(dǎo)速度最快，潛伏期最短，其后依次為B組和C組（P<0.05，表 1）。

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2.4 光鏡觀(guān)察結(jié)果 B、C組增生纖維組織較多，排列相對(duì)規(guī)整，有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多，直徑粗，排列相對(duì)整齊；A組增生纖維組織排列較雜亂，有髓神經(jīng)纖維相對(duì)少，直徑細(xì)。B、C組軸突數(shù)量多、直徑粗；A組軸突再生較差，軸突數(shù)目較少。在軸突數(shù)量和軸突直徑 C組＞B組＞A組（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

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3 討論

圖1 3組光鏡觀(guān)察結(jié)果

周?chē)窠?jīng)一旦發(fā)生損傷，神經(jīng)遠(yuǎn)端立即出現(xiàn)壞死、凋亡過(guò)程，之后才能進(jìn)行神經(jīng)再生。神經(jīng)再生具有以下特點(diǎn)[3]：（1）周?chē)窠?jīng)即軸突具有再生能力；（2）新生軸突沒(méi)有穿透能力；（3）神經(jīng)再生必須在合適的微環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。神經(jīng)吻合口與周?chē)M織粘連、瘢痕侵入神經(jīng)斷端、血運(yùn)障礙、局部水腫等因素均影響神經(jīng)再生。多數(shù)學(xué)者支持應(yīng)用神經(jīng)導(dǎo)管技術(shù)修復(fù)損傷神經(jīng)，促進(jìn)其再生[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)包埋的神經(jīng)吻合口與周?chē)M織基本沒(méi)有粘連，亦無(wú)明顯神經(jīng)瘤形成，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[7]。但神經(jīng)斷端的愈合只是神經(jīng)功能恢復(fù)的第一步，并且是目前能做到的最簡(jiǎn)單的一步。如何更好地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，更好地保留肢體的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能，更全面地恢復(fù)神經(jīng)受損前的狀態(tài)，需要面臨和解決更加復(fù)雜的問(wèn)題，需要更加優(yōu)化的微環(huán)境，而NGF在其中發(fā)揮著巨大的作用。

NGF及其受體在胚胎時(shí)期廣泛分布，在出生后其分布及含量均明顯下降，成年后則保持較低水平。但出現(xiàn)神經(jīng)損傷時(shí)，NGF則再次大量表達(dá)[8]，提示神經(jīng)修復(fù)過(guò)程需要大量NGF，但其本身無(wú)法產(chǎn)生足量的NGF。因此，提供外源性NGF可以促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)。外源性NGF無(wú)法通過(guò)血-神經(jīng)屏障，因此，全身給藥很難使其到達(dá)神經(jīng)軸突，通過(guò)局部給藥才能發(fā)揮其最大的生物學(xué)活性[9]。由于NGF半衰期只有幾分鐘，單次給藥無(wú)法保持其有效藥物濃度[10]。目前國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者研究NGF復(fù)合導(dǎo)管、明膠浸潤(rùn)NGF等緩釋系統(tǒng)已經(jīng)取得了一定成果[11-13]，但對(duì)于緩釋系統(tǒng)維持藥物的有效濃度、生物活性時(shí)間、緩釋速度等方面問(wèn)題尚無(wú)統(tǒng)一的定論。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，持續(xù)灌注NGF對(duì)于神經(jīng)恢復(fù)的促進(jìn)作用具有量效關(guān)系，即在一定范圍內(nèi)，劑量越高，效果越明顯，說(shuō)明增加外源性NGF可有效促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)，且劑量越大效果越好。分析原因可能是，在NGF受體尚未飽和前，增加外源性NGF可持續(xù)增加其與NGF受體的結(jié)合量，提高促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。但陳恒勝等[14]在大鼠損傷后周?chē)∪庾⑸洳煌瑒┝縉GF，連續(xù)2 w，結(jié)果顯示，中劑量組與低劑量組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而中劑量組與高劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不同，可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、給藥方式、持續(xù)給藥時(shí)間等因素不同有關(guān)。但本研究未灌注更高劑量的NGF，對(duì)于更高劑量NGF的量效性、安全性等方面尚需深一步的驗(yàn)證。

綜上所述，神經(jīng)離斷吻合后，包埋鞘內(nèi)灌注NGF可促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，且呈劑量依賴(lài)性。但本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳叭蕴幱趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，且對(duì)于藥物的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)、不良反應(yīng)等未進(jìn)行更深一步的研究。由于神經(jīng)損傷修復(fù)是一個(gè)系統(tǒng)復(fù)雜的過(guò)程，人體內(nèi)各種影響因素繁多，對(duì)于臨床用藥最佳方式、最佳劑量等尚需進(jìn)一步研究。

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