何淑貞,蒲育棟,蘇煥厚,曹金如,莫麗芳
地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血疾病,由基因缺陷導(dǎo)致機(jī)體珠蛋白合成受阻,引起患者貧血或臨床病理狀態(tài),一般從出生時(shí)就出現(xiàn)貧血、黃疸、發(fā)育不良等癥狀[1-2]。地中海貧血是重點(diǎn)防范遺傳性疾病之一,華南、西南地區(qū)是我國(guó)地中海貧血高發(fā)地區(qū),特別是廣西、廣東、四川等地區(qū)[3]。因此,孕前或孕期篩查,對(duì)預(yù)防地中海貧血患兒的出生十分關(guān)鍵。目前臨床上主要是針對(duì)23種常規(guī)地貧基因進(jìn)行篩查,操作過程復(fù)雜,且對(duì)檢測(cè)人員要求較高。而高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)可一次性檢測(cè)300多種地貧基因,篩查范圍廣,局限性小。因此,本研究以405例廣東籍夫婦為研究對(duì)象,探討NGS與常規(guī)篩查方法對(duì)地中海貧血基因篩查的結(jié)果。
1.1 研究對(duì)象 選取2014年10月~2016年10月在醫(yī)院進(jìn)行地中海貧血基因篩查的405例廣東籍夫婦為研究對(duì)象,其中男147例,女258例;年齡20~35(27.36±4.20)歲。 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)通過血常規(guī)檢測(cè),被視為地中海貧血篩查陽(yáng)性患者[平均紅細(xì)胞體積(MCV)<82 fl,紅細(xì)胞平均血紅蛋白量<27 pg,滿足任意一項(xiàng),被視為地中海篩查陽(yáng)性患者]。(2)擬行地中海貧血基因篩查。(3)無(wú)其他血液性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)基本資料不全;(2)患有其他血液性疾病;(3)精神異?;蛘J(rèn)知功能障礙。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.2 檢測(cè)方法 用EDTA抗凝管采集研究對(duì)象外周血,每人2管,每管約2 ml,分別用于常規(guī)地中海貧血基因檢測(cè)和高通量測(cè)序地貧基因篩查。
1.2.1 常規(guī)篩查 采用跨越斷裂點(diǎn)的PCR(gap-PCR)方法:利用基因檢測(cè)試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行基因診斷,檢測(cè)3種缺失型(-SEA、-α3.7 與-α4.2)α-地中海貧血基因。
采用反向點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù),檢測(cè)非缺失型(HbWS、HbCS 與 HbQS)α-地中海貧血基因突變及17種β-地中海貧血基因突變(包括71/71M、-28M、-29M、31M、32M、CAP、654M、14-15M、17M、41-42M、43M、βEM、27/28M、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM、30M)。
1.2.2 高通量測(cè)序 血液樣本-20℃儲(chǔ)存,寄往深圳華大基因公司,經(jīng)檢測(cè)合格后,首先進(jìn)行DNA提取、純化及質(zhì)量鑒定,之后文庫(kù)構(gòu)建和定量檢測(cè),然后采用HiSeq2500(Illumina)測(cè)序平臺(tái),采用雙端測(cè)序方法,測(cè)序長(zhǎng)度為150 bp,進(jìn)行基因組測(cè)序,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)兩種方法篩查結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果均為陰性的排除地貧,檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性者確診為地貧攜帶者,計(jì)算兩組檢查結(jié)果符合率。對(duì)兩組結(jié)果不一致的樣本,進(jìn)行Sanger驗(yàn)證(缺失重復(fù)突變用Q-PCR進(jìn)行驗(yàn)證),確定相關(guān)基因是否變異,分別統(tǒng)計(jì)兩種方法的假陽(yáng)性率、假陰性率、檢出率,并計(jì)算兩組每個(gè)樣本平均檢測(cè)費(fèi)用。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件分析,計(jì)量資料以±s表示,行t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例和百分率表示,行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組基因檢測(cè)結(jié)果比較 通過常規(guī)篩查、高通量技術(shù)及Sanger或Q-PCR驗(yàn)證,共確認(rèn)249例基因檢測(cè)為陽(yáng)性,其中α-地中海貧血基因168例(67.47%),β-地中海貧血基因72例(28.92%),α、β-地中海貧血基因9例(3.61%)。對(duì)照組檢出221例(88.76%),研究組檢測(cè)出247例(99.20%),研究組的檢出率高于對(duì)照組,但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.2 兩組基因篩查結(jié)果比較 研究組檢測(cè)23種常規(guī)地中海貧血基因的結(jié)果與對(duì)照組基本一致(表1)。此外,研究組還檢測(cè)出25例對(duì)照組未檢測(cè)出的7種突變(4 例 HbHekinan:α27,6 例 HbOwari:α121,3例 HbQ-Thailand:α74,5 例 Hb Hamilton:β11,2 例 Hb New York:β113,3 例 HBB:c.-23,2 例 HBB:c.316-148),與Sanger或Q-PCR驗(yàn)證結(jié)果完全一致。
2.3 兩組樣本平均檢測(cè)費(fèi)用比較 觀察組每份樣本平均檢測(cè)費(fèi)用為(550.88±60.31)元,顯著高于對(duì)照組的(423.47±61.44)元(P<0.05)。
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地中海貧血是臨床重點(diǎn)預(yù)防的遺傳性疾病,孕期或孕前地中海貧血基因篩查是防止地中海貧血患兒出生的關(guān)鍵[4-5]。目前臨床上常用的基因檢測(cè)方法大多還停留在跨越斷裂點(diǎn)PCR及膜芯片反向雜交聯(lián)合檢測(cè),步驟繁瑣,對(duì)檢測(cè)技術(shù)人員要求較高,并且跨越斷裂點(diǎn)PCR主要是針對(duì)α-地貧基因的檢測(cè),而膜芯片反向雜交主要是針對(duì)β-地貧基因,局限較大[6]。而高通量測(cè)序可一次檢測(cè)338種地中海貧血基因突變,效率較高,且準(zhǔn)確率高。
在本研究中,405例疑似地中海貧血癥者中,共確認(rèn)249例基因檢測(cè)為陽(yáng)性,其中常規(guī)篩查檢出221例(88.76%),高通量測(cè)序檢測(cè)出247例(99.20%)。其中NGS檢測(cè)23種常規(guī)地貧基因的結(jié)果與常規(guī)篩查方法相同。同時(shí)研究組還檢測(cè)出25例對(duì)照組未檢測(cè)出的7種基因突變類型,且與Sanger測(cè)序或QPCR驗(yàn)證結(jié)果完全一致。提示研究組的檢出率高于對(duì)照組,同時(shí)研究組還檢測(cè)出對(duì)照組未檢測(cè)出的突變基因型,表明高通量測(cè)序技術(shù)可提高檢出率,且檢測(cè)范圍廣、效率高,有利于臨床地中海貧血基因的篩查,與陳芳等[7]在母血中胎兒游離DNA進(jìn)行地中海貧血的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究結(jié)果相似。
高通量測(cè)序技術(shù)從分子生物學(xué)的角度去解讀樣本的生物信息,具有高效性、廣譜性及較高的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示,觀察組單個(gè)樣本基因檢測(cè)平均費(fèi)用顯著高于對(duì)照組(P<0.05),由于NGS需要在華大基因進(jìn)行檢測(cè),所以在費(fèi)用方面處于劣勢(shì)。但近年來二代測(cè)序平臺(tái)不斷更迭,測(cè)序成本正在逐漸下降,因此,未來測(cè)序成本將不會(huì)是高通量測(cè)序技術(shù)臨床應(yīng)用的限制因素。
總之,高通量測(cè)序技術(shù),檢出率較高,篩查范圍廣,效率高,有利于臨床地中海貧血基因的篩查。
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