韋龍生 韓 璐 楊 錚 王麗佳 王羚鴻 劉陶迪** 張信來

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室（內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科

Abstract ObjectiveTo study the transcriptional expression ofCatsperg1in the development of rat testes and its effect on sperm maturation.MethodsMale Wistar rats at 21 time points of age (frome 2 to 65 days) were given, and their testis tissues at three different litter were collected at each time point.Total mRNA was extracted from rat testis tissues and reverse transcribed into cDNA, and then amplified for detection the transcription expression ofCatsperg1by real-time PCR.ResultsThe mRNA expression ofCatsperg1began to increase slowly at the 20th day after birth, reached the peak at the 50th and 55th day, and remained at the peak at the 60th and 65th day.ConclusionThe expression ofCatsperg1in rat testis gradually increased, which may be involved in the regulation of sperm maturation.

Key wordsCatsperg1; gene expression; spermatogenesis; rats; sperm maturation

近年來，不育不孕的發(fā)病率逐年提高，困擾著許多已婚夫婦，其中男方因素約占百分之五十，導(dǎo)致男性不育的原因有很多，其中包括精液異常、生精障礙、輸精管梗阻和全身性因素（精神和環(huán)境因素、營養(yǎng)因素、內(nèi)分泌疾?。?，其中生精障礙是引起男性不育的重要原因。

精子發(fā)生的分子機(jī)制是當(dāng)前精原干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。盡管參與精子發(fā)生的眾多基因有許多生物學(xué)特征[1]，但在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)峰值方面主要體現(xiàn)在三個(gè)階段：第一，有絲分裂階段，即出生后0～8d，此時(shí)精原干細(xì)胞以增殖為主；第二，減數(shù)分裂開始，即出生后14d左右，此時(shí)初級精母細(xì)胞出現(xiàn)；第三，進(jìn)入精子發(fā)生之后，即出生20d之后，此時(shí)圓形精子首次出現(xiàn)[2,3]，出生35d后完成圓形精子向長形精子的變形，成熟的精子出現(xiàn)。出生56d后大鼠性成熟，達(dá)到成年?duì)顟B(tài)[4,5]。

大鼠中的Catsperg1基因，也叫Catsperg基因，兩者為同源性基因。Catsperg基因是Catsper精子鈣通道上的一個(gè)亞基[6]，是精子超激活運(yùn)動和男性生育能力所必需的基因,精子細(xì)胞過度活化可能是通過Catsper1，精子細(xì)胞過度活化是精子活力所必需的，精子活力是精子受精過程所需條件。

本實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR技術(shù)，檢測大鼠睪丸組織Catsperg1基因的mRNA表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究該基因的蛋白表達(dá)情況提供依據(jù)，從而研究該基因在精子功能中的作用。

材料與方法

一、材料

總RNA提取試劑盒（DP419）購自TIANGEN公司，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑從大連寶生物公司購買，引物由上海生物工程公司合成。

二、實(shí)驗(yàn)動物

從內(nèi)蒙古大學(xué)購買出生10周左右的Wistar大鼠，并在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物中心飼養(yǎng)，將雄鼠與雌鼠合籠，自然交配，每周換墊料1次，保持飼料和飲水的干凈和充足。第8天后分籠，第18～20天后開始每天觀察雌鼠3次，記錄鼠出生的具體時(shí)間。出生當(dāng)天記成第1天（1日齡），編號飼養(yǎng)。

三、實(shí)驗(yàn)樣本采集

將出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65日齡的雄鼠用脊椎脫臼法處死，取睪丸組織，每個(gè)日齡取3只不同窩別的大鼠。

1.各個(gè)時(shí)間點(diǎn)總RNA的提取

取出的睪丸組織按照總RNA提取試劑盒（TIANGEN，DP419）上的使用說明書進(jìn)行操作，從總的RNA管中分裝出2μL在超微量紫外分光光度儀（ Thermo ND 2000L）測定其RNA濃度(Conc)和純度(A260：A280比值)，RNA濃度測3次取其平均值，A260/A280比值保持在1.95～2.10之間?？偟腞NA管放入-80℃冰箱保存。

四、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

規(guī)定稀釋后每管樣品質(zhì)量為1μg，濃度為0.15μg/μL，根據(jù)測得樣品的RNA濃度，可以計(jì)算出所需mRNA體積。反轉(zhuǎn)錄體系為20μL， A液10μL（稀釋后RNA 6.67μL，10μm oligo-dt 1μL，RNase-Free dH2O 2.33μL），B液10μL（5×RT-MMlV Buffer 4μL，dNTPs(10mM)2μL，RRI(10μ/μL)1μL，RT-M-Mlv 0.5μL，RNase-Free H2O 2.5μL），A液65℃水浴5min，B液與A液混合后42℃水浴1h，70℃水浴10min，最后-20℃保存。

五、Catsperg1基因引物設(shè)計(jì)

引物序列見表1。

表1 寡核苷酸引物列表

六、Real-time PCR方法檢測Catsperg1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

以該 cDNA 為模板對部分Catsperg1片段進(jìn)行擴(kuò)增，在8×12的96板孔中，在每個(gè)孔20μL的反應(yīng)液總體積中依次加入下列物質(zhì)：RNase-Free dH2O 7μL，兩個(gè)引物各0.8μL，Extaq酶 10μL，Rox 0.4μL，cDNA 1μL，按照第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的21個(gè)時(shí)間點(diǎn)的cDNA依次加入反應(yīng)液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)液重復(fù)一次，并帶兩個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的GAPDH的反應(yīng)液，GAPDH做內(nèi)參對照，H2O做陰性對照，采用Ct方法分析Catsperg1mRNA的表達(dá)量，結(jié)果用基因mRNA相對表達(dá)倍數(shù)表示，計(jì)算方法用2-ΔΔCt法，數(shù)據(jù)和圖表使用Microsoft Excel軟件分析[7]。

結(jié) 果

一、Real-time PCR檢測Catsperg1基因在三組不同窩別大鼠早期發(fā)育睪丸組織中mRNA水平的表達(dá)情況

根據(jù)引物的溶解曲線可知，重合度高，其特異性好（圖1A，圖1C）。擴(kuò)增曲線在PCR平臺期幾乎重合（圖1B，圖1D）。

通過Real-time PCR反應(yīng)檢測到Catsperg1基因在3組不同窩別的大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天睪丸組織中的表達(dá)模式（圖2），3組不同窩別的大鼠睪丸組織mRNA水平表達(dá)趨勢基本一致；第2天至第65天的大鼠睪丸組織mRNA表達(dá)差異明顯。Catsperg1mRNA表達(dá)在第2天到第16天幾乎沒有，到第20天開始逐漸增加，到第29天達(dá)到一個(gè)小高峰又逐漸下降到第30天，之后從第30天到65天表達(dá)再次迅速升高，形成一個(gè)高峰，并維持一定峰值。

圖1 Catsperg1和Gapdh的溶解曲線和擴(kuò)增曲線

圖2 Catsperg1基因在3組不同窩別大鼠出生后第2天至第65天睪丸組織中mRNA的相對表達(dá)量

討 論

哺乳動物精子發(fā)生是一種細(xì)胞分化的連續(xù)體，其中可以分為3個(gè)主要階段：精原細(xì)胞的增殖，減數(shù)分裂和精子形成。精子發(fā)生由干細(xì)胞（原始型A型精原細(xì)胞）的分裂引發(fā)，Ap型精原細(xì)胞分化增殖為兩個(gè) B 型精原細(xì)胞。B型精原細(xì)胞分裂增殖為初級精母細(xì)胞，精母細(xì)胞經(jīng)歷了減數(shù)分裂的不同階段，第一次分裂后形成次級精母細(xì)胞，染色體數(shù)目減少一半，第二次分裂后形成圓形精子細(xì)胞， 隨后，圓形精子細(xì)胞經(jīng)過復(fù)雜顯著的形態(tài)變化，形成延長的精子細(xì)胞，然后發(fā)育為成熟精子[2]。這種復(fù)雜的過程由數(shù)千個(gè)基因在生殖細(xì)胞發(fā)育的特定階段選擇性表達(dá)。在精子發(fā)生過程中，這些基因的表達(dá)在精子發(fā)生過程起調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄和翻譯控制機(jī)制負(fù)責(zé)時(shí)間和階段特異性表達(dá)模式[8,9]。

Catsperg1基因是Ca2+通道蛋白家族之一[10,11]，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道該基因位于哺乳動物精子膜表面的Ca2+通道，負(fù)責(zé)胞內(nèi)外 Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，調(diào)控精子活力、超活化、精子獲能和頂體反應(yīng)等生理過程[12-14]。Catsperg1基因是Catsper精子鈣通道上的一個(gè)亞基[6]，而Catsper精子鈣通道是具有電壓依賴性，Ca2+選擇性，pH敏感性。它控制帶正電Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞，這是精子過活化和男性生殖力所必需的[15,16]。

本實(shí)驗(yàn)通過對Catsperg1基因在大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的表達(dá)模式的檢測，可以觀察到，Catsperg1基因在大鼠出生早期，幾乎不轉(zhuǎn)錄，直到第20天mRNA表達(dá)才開始增加，在第29天有個(gè)小高峰，之后從第30天表達(dá)又逐漸增加，在第50天表達(dá)達(dá)到最高值，之后維持一定峰值。第20天正好是圓形精子出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)，20d到65d，圓形精子經(jīng)過復(fù)雜的變態(tài)發(fā)育后形成成熟的精子，因此可以推測Catsperg1基因可能與精子成熟有關(guān)，并在其中發(fā)揮重要的作用。

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以總結(jié)以下結(jié)論：（1）Catsperg1基因表達(dá)與精子發(fā)生有相關(guān)性；（2）Catsperg1基因在大鼠睪丸組織中晚期發(fā)育的表達(dá)量逐漸升高，可能參與精子成熟。本實(shí)驗(yàn)揭示了Catsperg1基因與精子有相關(guān)性，為下一步對該基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1 蔡志明, 孫亮, 唐愛發(fā).睪丸基因表達(dá)特征和生物學(xué)功能的研究.中國男科學(xué)雜志 2010; 24(1): 3-8

2 Clermont Y.kinetics of spermatogenesis in mammals：seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.Physiol Rev1972; 52: 198-236

3 Sha J, Zhou Z, Li J,et al.Spermatogenesis Study Group,Identification of testis development and spermatogenesisrelated genes in human and mouse testes using cDNA arrays.Mol Hum Repord2002; 8: 511-5 l 7

4 夏小雨, 陳學(xué)進(jìn).哺乳動物精子發(fā)生中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的特點(diǎn).醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志 2008; 5(1): 65-68

5 Wojtasz L, Daniel K, Roig I,et al.Mouse HORMAD1 and HORMAD2, two conserved meiotic chromosomal proteins,are depleted from synapsed chromosome axes with the help of TRIP13 AAAATPase.PLoS Genet5 2009: e1000702

6 Wang H1, Liu J, Cho KH,et al.A novel, single,transmembrane protein CATSPERG is associated with CATSPER1 channel protein.Biol Reprod2009; 81(3):539-544

7 陳涵斌, 馬駿, 李慧敏, 等.鄰苯二甲酸酯染毒哺乳期母鼠對雄性仔鼠Leydig 細(xì)胞形態(tài)及功能的影響.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志 2015; 31(2): 97-101

8 Hecht NB.Molecular mechanisms of male germ cell differentiation.Bioessays 1998; 20(7): 555-561

9 Eddy EM, O'Brien DA.Gene expression during mammalian meiosis.Curr Top Dev Biol1998; 37:141-200.Google ScholarPubMed

10 Liu J, Xia J, Cho KH,et al.CatSperbeta, a novel transmembrane protein in the CatSper channel complex.J Biol Chem2007; 282(26): 18945-18952

11 Wang H, Liu J, Cho KH,et al.A novel, single,transmembrane protein CATSPERG is associated with CATSPER1 channel protein.Biol Reprod2009; 81(3):539-544

12 Darszon A, Acevedo JJ, Galindo BE,et al.Sperm channel diversity and functional multiplicity.Reproduction2006;131(6): 977-988

13 Jimenez-Gonzalez C, Michelangeli F, Harper CV,et al.Calcium signalling in human spermatozoa: a specialized' toolkit' of channels,transporters and stores.Hum Reprod Update2006; 12(3): 253-267

14 張瑞芳, 曾海濤.鈣離子通道與精子運(yùn)動功能.生命的化學(xué) 2009; 29(6): 878-882

15 Lishko PV, Botchkina IL, Kirichok Y.Progesterone activates the principal Ca2+channel of human sperm.Nature2011; 471: 387-391

16 Shukla KK, Mahdi AA, Rajender S.Ion channels in sperm physiology, male fertility and infertility.Andrology2012; 33: 777-788