董偉航 金保方 孫大林 蔡 濱鄧偉民 崔毓桂 童 麗 吳 萍**

1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院（西寧 810001）；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科；3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科

生精障礙是臨床治療少、弱、無(wú)精子癥患者時(shí)所面臨的直接問(wèn)題。精子的發(fā)生乃至成熟受到多重因素的調(diào)節(jié)，越來(lái)越多研究證實(shí)精子發(fā)生與睪丸微循環(huán)之間存在緊密聯(lián)系，生精小管的高代謝環(huán)境需要睪丸充足的血流灌注[1]，而無(wú)精子癥患者睪丸生精環(huán)境破壞的同時(shí)微循環(huán)調(diào)控能力亦下降[2]。

中醫(yī)認(rèn)為，補(bǔ)腎填精可以促進(jìn)精子發(fā)生。然而，單純通過(guò)補(bǔ)腎填精治療男性不育癥，在臨床實(shí)踐過(guò)程中，或效或不效，已經(jīng)引發(fā)了人們的廣泛思考。

改善睪丸微循環(huán)，在補(bǔ)腎填精的基礎(chǔ)上加以養(yǎng)血活血，能否改觀單純補(bǔ)腎填精“或效或不效”的問(wèn)題？研究團(tuán)隊(duì)在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的補(bǔ)腎精代表中藥五子衍宗丸相比，補(bǔ)腎活血中藥養(yǎng)精膠囊（Yangjing Capsule, YC）能夠更加顯著的提高男性不育癥患者的精子數(shù)量和活力[1]。而后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)：YC可以顯著改善環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide,CP）所致生殖損傷小鼠的睪丸、附睪損傷情況，降低CP所致的生精細(xì)胞凋亡及凋亡率，促進(jìn)精子發(fā)生[1]。我們推測(cè)YC改善CP小鼠生精障礙的機(jī)制亦與其改善睪丸微循環(huán)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CP模型組小鼠與YC治療組（低、中、高劑量）小鼠之間睪丸CD34、VEGFR2、SRC及AKT1的表達(dá)變化，明確了補(bǔ)腎活血方對(duì)CP模型小鼠睪丸微循環(huán)的改善作用并初步探索了其機(jī)制。

材料與方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性BALB/c小鼠（清潔級(jí)）60只，8～10周齡，體質(zhì)量（20±2）g。實(shí)驗(yàn)室溫度 （21±2）℃，相對(duì)濕度40%～70%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（二）藥物與試劑

養(yǎng)精膠囊，0.5g /粒 [南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，院臨 ( 2004) 第 01002 號(hào)]；注射用環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)股份有限公司）；40×檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液（Beyotime，P0086）；封閉用正常山羊血清工作液（ZSGB-BIO，ZLI-9022）；免疫染色一抗稀釋液（Beyotime，P0103）；即用型免疫組化EliVision plus試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，Kit-9901）；DAB顯色試劑盒（博士德生物，AR1022）；MiniBEST Univerasl RNA Extraction Kit（Takara，9767）；Prime ScriptTM RT Master Mix（Takara，RR036B）；SYBR?Primix Ex TaqTM（Takara，RR420B）；RIPA裂解液（Beyotime，P0013C）；PMSF（Beyotime，ST506）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime，P0010）；NuPAGETM 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 15-well（Thermo Fisher，NP0336BOX）；NuPAGETM MOPS SDS Running Buffer（ThermoFisher，NP0001）；NuPAGETM Sample Reducing Agent（ThermoFisher，NP0004）；NuPAGETM LDS Sample Buffer（ThermoFisher，NP0007）；CD34 Antibody（proteintech，14486-1-AP）；VEGF Receptor 2 Rabbit Polyclonal antibody（proteintech，26415-1-AP）；Albumin Bovin V（BIOSHARP）；SRC Rabbit Polyclonal antibody（proteintech，11097-1-AP）；AKT1 Rabbit Polyclonal antibody（proteintech，10176-2-AP）；GAPDH Antibody（proteintech，10494-1-AP）；alpha Tubulin Rabbit Polyclonal antibody（proteintech，11224-1-AP）；Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（Jackson ImmunoResearch，103599）；Western一抗稀釋液（Beyotime，P0023A）；Western二抗稀釋液（Beyotime，P0023D）；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore，WBKLS0100 )。

（三）儀器

BMJ-III型包埋儀（常州市中威電子儀器有限公司）；切片機(jī)（Peica）；恒溫振蕩器（國(guó)華，ZD-85）；倒置熒光顯微鏡（Nikon，TI-DH）；混合器（太倉(cāng)市科教器材廠）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf AG，5404）；核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf AG，6132）；PCR儀（Eppendorf AG，5333）；StepOnePlus?Real-Time PCR System（ThermoFisher）；勻漿器（IKA）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ThermoFisher，1510）；垂直電泳系統(tǒng)（BIORAD，PowerPacTM Basic）；曝光機(jī)（Tanon，4200F）。

二、方法

（一）分組與給藥

60只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、YC低劑量組、YC中劑量組、YC高劑量組（每組12只）。除空白組外，其余小鼠腹腔注射CP 50 mg/kg，空白組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射7d，各組常規(guī)喂養(yǎng)。

而后每日灌胃給藥1次，其中空白組、模型組取生理鹽水（10 ml/kg），YC低、中、高劑量組取生理鹽水配置的YC混懸液（新鮮配置，取YC內(nèi)容物用生理鹽水溶解，分別配置成0.063 g/mL、0.126 g/mL與0.252 g/mL，低、中、高劑量組分別根據(jù)小鼠體質(zhì)量按原藥取0.63 g/kg，1.26 g/kg，2.52 g/kg灌胃），連續(xù)30d，期間常規(guī)喂養(yǎng)。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

第30日給藥1h后，脫頸處死各組小鼠，摘取雙側(cè)睪丸。各組小鼠組內(nèi)隨機(jī)各半分A、B兩組（每組6只），A組睪丸固定24h后脫水，石蠟包埋，B組睪丸-70℃凍存。

1.組織石蠟切片HE染色觀察組織形態(tài)：石蠟切片5μm，60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，梯度水化。蘇木素浸染5min，自來(lái)水沖洗10min。0.5% HCL（75%乙醇配）分化10s，自來(lái)水沖洗1min。伊紅浸染2min，自來(lái)水沖洗1min。梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，通風(fēng)櫥晾干。鏡下觀察染色情況。

2.組織石蠟切片免疫組化檢測(cè)CD34染色：石蠟切片5μm，60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，梯度水化。切片滴加3%雙氧水室溫避光孵育10 min，雙蒸水沖洗3min×3。切片泡入雙蒸水稀釋的1×檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液中，置微波爐高火5min而后低火15min，自然冷卻。滴加5%山羊血清37℃封閉30min。以免疫染色一抗稀釋液配置CD34一抗（1:50），37℃搖床孵育90min，PBS沖洗3min×3。按免疫組化試劑盒說(shuō)明孵育二抗。滴加DAB染料，鏡下觀察顯色后雙蒸水充分沖洗。蘇木素復(fù)染5min，0.5% HCL（75%乙醇配）分化10s，雙蒸水反藍(lán)。梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，通風(fēng)櫥晾干。鏡下觀察染色情況。

3.RT-qPCR檢測(cè)組織Vegfr2、Src、Akt1的mRNA表達(dá)：以RNA提取試劑盒提取組織RNA，RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，而后配置20μL上樣體系進(jìn)行qPCR檢測(cè)。上樣體系為：SYBR 10μL，dH2O 7μL，ROX 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，cDNA 1μL。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，序列如下，Vegfr2上游：CATTATCCTCGTCGGCACT，下游：GCATCATAAGGCAAGCGTTC；Src上游：CAGGACAGAATACGGAGACCA，下游：TTGGCCTAAAGACCCTGTTG；Akt1上游：GACTGTGGCAGATGGACTCA，下游：CCAGAATCACCTTCCCAAAG；β-actin上游：GCTACAGCTTCACCACCACAG，下游：GGTCTTTACGGATGTCAACGTC。反應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)兩步法，以2-ΔΔCT相對(duì)定量法處理數(shù)據(jù)而后比較各組mRNA表達(dá)情況。

4.Western-blotting檢測(cè)組織VEGFR2、SRC、AKT1的蛋白表達(dá)：以預(yù)先加入1% PMSF的RIPA裂解液提取組織蛋白，勻漿器勻漿?；旌掀髡袷?0s，冰上靜置10min，重復(fù)2次。4℃ 12000×g，離心30min，取上清液以BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按預(yù)制膠說(shuō)明配置上樣體系。而后進(jìn)行Westernblotting。其中一抗稀釋比例如下，CD34：1/500，VEGFR2：1/500，SRC：1/500，AKT1：1/500，GAPDH：1/10000，α-TUBLIN：1/1000，二抗稀釋比例為1/10000，封閉液為TBST配置的5% BSA。一抗4℃搖床孵育16h，二抗37℃搖床孵育1h。曝光后取相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較各組蛋白表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組小鼠睪丸HE染色組織形態(tài)

從睪丸組織形態(tài)來(lái)看，空白組小鼠生精小管形態(tài)正常，各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊、有序，管腔中可見(jiàn)大量成形的精子，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目亦正常。模型組小鼠可見(jiàn)生精小管缺損，管腔內(nèi)幾乎無(wú)成熟精子，間質(zhì)細(xì)胞明顯減少。YC低劑量組生精上皮仍薄且有生精細(xì)胞缺失，但部分管腔中可見(jiàn)少量成熟的精子，間質(zhì)細(xì)胞增多。YC中劑量組小鼠生精上皮增厚，各級(jí)生精細(xì)胞排列有序，部分管腔中可見(jiàn)大量成熟精子，且間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增多。YC高劑量組小鼠生精小管形態(tài)接近正常，多數(shù)管腔中可見(jiàn)大量成熟精子，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)數(shù)目恢復(fù)較好（圖1）。

二、各組小鼠睪丸CD34免疫組化染色及蛋白表達(dá)情況

從CD34免疫組化染色結(jié)果來(lái)看，模型組染色明顯弱于空白組，而YC低、中、高劑量組染色逐步加深（圖1）。

從Western-Blotting結(jié)果來(lái)看，模型組CD34蛋白表達(dá)明顯低于空白組，而YC高劑量組CD34蛋白表達(dá)明顯高于模型組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖1 養(yǎng)精膠囊對(duì)小鼠睪丸組織形態(tài)及CD34免疫組化染色強(qiáng)度的影響（400×）

圖2 養(yǎng)精膠囊對(duì)小鼠睪丸CD34蛋白表達(dá)的影響

三、各組小鼠睪丸VEGFR2、SRC、AKT1的mRNA與蛋白表達(dá)情況

模型組小鼠睪丸Vegfr2的mRNA表達(dá)明顯高于空白組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而模型組小鼠睪丸VEGFR2的蛋白表達(dá)較空白組明顯下降，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；YC高劑量組小鼠睪丸VEGFR2的蛋白水平較模型組明顯上升，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。各組小鼠睪丸在Src與Akt1的mRNA表達(dá)上無(wú)統(tǒng)計(jì)差異（P＞0.05），但在蛋白表達(dá)上，模型組小鼠睪丸SRC表達(dá)較空白組明顯降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而YC高劑量組小鼠睪丸SRC蛋白水平較模型組明顯提高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。模型組AKT1蛋白表達(dá)較空白組明顯下降，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；YC治療組小鼠睪丸AKT1蛋白表達(dá)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

圖3 養(yǎng)精膠囊對(duì)小鼠睪丸VEGFR2、SRC、AKT1的mRNA與蛋白表達(dá)的影響

討 論

血管內(nèi)皮因子通路VEGF通路是血管生成的經(jīng)典通路，VEGFA與其受體VEGFR2的結(jié)合可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷徙[5]，其對(duì)于睪丸微血管生成，血流灌注，以及睪丸微環(huán)境的改善起著至關(guān)重要的作用。目前我們發(fā)現(xiàn)血管VEGF/VEGFR2可通過(guò)PI3K/AKT通路與SRC因子兩條支線作用于內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）進(jìn)而促進(jìn)血管生成。VEGFA于細(xì)胞膜與VEGFR2結(jié)合后，VEGF/VEGFR2激活鈣蛋白酶2，而后鈣蛋白酶2于胞膜與埃茲蛋白及磷酸肌醇結(jié)合，該復(fù)合物進(jìn)而刺激PI3K/AMPK/AKT通路促使eNOS合成與NO分泌，同時(shí)通過(guò)刺激蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶1B（protein phosphotyrosine phosphatase 1B，PTP1B）負(fù)反饋于VEGFR2[6]。VEGFR2在絡(luò)氨酸磷酸化后激活A(yù)KT，而eNOS的絲氨酸177位點(diǎn)經(jīng)AKT或PKA磷酸化進(jìn)而激活NO的分泌[7]。VEGFR2亦可通過(guò)pY949（小鼠）或pY951（人）引起SRC表達(dá)上升[8]。細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）可磷酸化SRC的Tyr783位點(diǎn)，激活磷脂酶C?（PLC?），進(jìn)而激活Ca+/CaM通路。而VEGFA/VEGFR2亦是通過(guò)PI3K/AKT通路與Ca+/CaM通路激活eNOS進(jìn)而促進(jìn)NO分泌[8]。學(xué)者將PI3K的酪氨酸磷酸化過(guò)程細(xì)化為SRC經(jīng)PKA激活，而后抑制PP1，誘導(dǎo)CaMKII和Pyk2活化，進(jìn)而使PI3K酪氨酸磷酸化[14]，此過(guò)程提示SRC亦參與調(diào)控PI3K/AKT通路。而對(duì)于CD34，其作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物，已有學(xué)者證實(shí)其在大鼠睪丸表達(dá)并將其作為反映睪丸微血管密度的指標(biāo)[10]。

血管生成與精子發(fā)生之間存在緊密聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6周齡VEGFA敲除小鼠附睪成熟精子與未分化的精原細(xì)胞均明顯減少，睪丸生精小管生精細(xì)胞大量缺失且在部分生精小管中排列紊亂[12]。以SH5抑制AKT磷酸化后，研究人員發(fā)現(xiàn)種馬精子總數(shù)和活力被明顯抑制，同時(shí)伴隨著線粒體膜電位降低，精子CASP3與CASP7表達(dá)明顯上升[13]。

“精者血之所成也”，“血即精之屬也”，精和血都由水谷精微化生和充養(yǎng)，化源相同，兩者相互滋生，相互轉(zhuǎn)化，此為“精血同源”?！懊}者，資始于腎間動(dòng)氣”，“夫血者，水谷之精氣也，和調(diào)于五臟，灑陳于六腑，男子化而為精，女子上為乳汁，下為經(jīng)水”，血管的形成需要腎精的滋養(yǎng)，精子的發(fā)生亦需要血的充盈。補(bǔ)腎活血方養(yǎng)精膠囊由熟地黃、淫羊藿、黃芪、當(dāng)歸、炙水蛭、王不留行、荔枝核、紫河車、黃精、煅牡蠣、沙苑子11味中藥組成，方中熟地黃滋腎益陰，養(yǎng)血填精；淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)，祛風(fēng)除濕。兩者共為君藥，滋陰扶陽(yáng)、補(bǔ)腎填精。黃芪、當(dāng)歸取當(dāng)歸補(bǔ)血湯之意，合“精血同源”之理，養(yǎng)血補(bǔ)精之功，共為臣藥。炙水蛭、王不留行、荔枝核活血通經(jīng)，理氣逐瘀，改善睪丸微循環(huán)，為佐藥。紫河車乃血肉有情之品，益氣養(yǎng)血，補(bǔ)腎益精；黃精乃坤土之精，益氣養(yǎng)陰，滋腎填精；煅牡蠣益精收澀，沙苑子補(bǔ)腎固精，共助封藏，共為使藥。因此，我們把養(yǎng)精膠囊作為以補(bǔ)腎活血法治療男性生精障礙的代表方藥，同時(shí)結(jié)合當(dāng)代社會(huì)人體微循環(huán)功能普遍下降的特點(diǎn)，依據(jù)“精血同源”理論以補(bǔ)腎活血方養(yǎng)精膠囊治療男性不育癥，尤其是特發(fā)性少、弱、無(wú)精子癥療效確切[14-16]。

CP不僅抑制睪丸生精能力，其對(duì)組織血管生成亦有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)CP可使小鼠腹膜內(nèi)腫瘤周圍血管變薄變細(xì)并使得腹水VEGFA濃度明顯降低[11]。在前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)YC改善CP致生精障礙模型小鼠生精功能的基礎(chǔ)上，本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CP能夠引發(fā)小鼠睪丸微循環(huán)損傷，而YC能夠通過(guò)上調(diào)小鼠睪丸VEGF/VEGFR2相關(guān)通路中VEGFR2與SRC的蛋白表達(dá)進(jìn)而改善CP模型小鼠微循環(huán)，且極可能由此進(jìn)一步改善小鼠生精能力。CP能明顯降低小鼠睪丸AKT1的蛋白表達(dá)，但遺憾的是本次實(shí)驗(yàn)YC并未逆轉(zhuǎn)CP對(duì)小鼠睪丸AKT1的抑制作用，我們推測(cè)原因有兩點(diǎn)，其一是YC僅通過(guò)VEGFR2/SRC/eNOS通路改善小鼠睪丸微循環(huán)，但在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)CP顯著誘發(fā)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡，YC能明顯降低BAX/BCL-2的基因和蛋白表達(dá)水平比值從而抑制CP引起的生精細(xì)胞凋亡[1]，而AKT可磷酸化BAD，阻斷BAD對(duì)BCL-2的抑制進(jìn)而拮抗凋亡[17]，結(jié)合AKT作用機(jī)制可知AKT需經(jīng)磷酸化方能激活[7,9]，所以我們更偏向于第二個(gè)原因，即是YC提升了CP小鼠磷酸化AKT（P-AKT）水平而使得AKT水平相對(duì)無(wú)差異。若有機(jī)會(huì)，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證這一點(diǎn)。

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