孫寶剛 管福來 曹井賀** 梁魯南 董業(yè)浩 房 姣 楊愛軍

1.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院（山東濟寧 272000）；2.濰坊醫(yī)學院

目前，世界范圍內(nèi)不育影響著近20%的夫婦，其中，男性因素約占50%[1]。隨著臨床先進診斷技術(shù)的應用，多數(shù)男性不育的病因已被確定，但仍有30%～40%病例尚無法探知其確切病因，被診斷為特發(fā)性男性不育癥（包括特發(fā)性少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥）[2]。

資料與方法

一、研究對象

收集在我院生殖醫(yī)學科就診的132例特發(fā)性男性不育癥患者為實驗組以及50例已生育的成年健康男性為對照組，在我們的研究中，無論是常規(guī)體外受精（IVF）周期還是卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）周期，雙原核受精率的計算都是雙原核受精卵子數(shù)除以獲卵數(shù)。將132例患者分為IVF治療周期組72例，ICSI治療組60例納入本項研究。

為盡量減少外變量的影響，回顧性研究對患者的入選條件進行了嚴格規(guī)定。特發(fā)性少弱畸精子癥符合 WHO-5推薦標準診斷。無遺傳性疾病史、無傳染性疾病、無接觸 X 光和有害化學物質(zhì)史，排除先天畸形、睪丸發(fā)育不良、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖道感染、隱睪癥、睪丸萎縮；精路梗阻、精索靜脈曲張等病史及其他可能導致男性不育癥的，屬原因不明確的特發(fā)性男性不育癥。為減少女方因素對結(jié)果的影響，我們規(guī)定女方年齡在35歲及以下，繼發(fā)不孕，不孕年限為1.5至8年，且第一次行IVF/ICSI治療，僅有單純輸卵管因素，沒有其他相關(guān)婦科病史和盆腔手術(shù)史,且至少獲得了 5枚MII卵。

本項研究得到了我院生殖醫(yī)學倫理委員會的批準。所有的研究對象均在自愿的前提下簽署了科研知情同意書。

二、方法

（一）實驗方法

1.精液常規(guī)分析。

2.計算機輔助精子分析（CASA）：采用計算機輔助精子分析儀(西班牙，SCA)檢測精子密度、總數(shù)、各級運動精子百分率和數(shù)量等。

3.精子形態(tài)學分析（Diff-Quik法）：檢測精子形態(tài)正常率=正常形態(tài)精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%

4.精子功能檢查：依照 WHO 技術(shù)規(guī)范采集、處理和檢測精液標本， 檢測實驗組與對照組相關(guān)精子功能指標水平。精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率；精子核蛋白不成熟率；精子DNA 碎片率，頂體酶檢測均采用深圳市博銳德生物科技有限公司產(chǎn)品試劑盒，檢測操作均按試劑盒說明書要求進行。

5.精子處理：將實驗組與對照組的男性精液標本采用密度梯度分離法分離：其具體步驟為：取精子密度梯度分離培養(yǎng)基，吸取1mL下層（高密度）分離培養(yǎng)基置于離心管中，再吸取1mL上層分離培養(yǎng)基（低密度）緩慢地注于下層分離培養(yǎng)基的上面.兩層培養(yǎng)基的中間形成一個清晰的界面，37℃培養(yǎng)箱復溫。小心吸取1mL培養(yǎng)基化的精液覆蓋于上層分離培養(yǎng)基的液面。以（300～600）×g的速度離心20min。移去所有的分層溶液，只剩底部的沉淀。加2～3mL洗精培養(yǎng)基，將沉淀混勻。200×g離心5min。移去上清，再加入洗精培養(yǎng)基，重復離心洗滌步驟。用0.5mL IVF受精培養(yǎng)基沉淀。進行精于計數(shù)和精子質(zhì)量評估。將處理獲得的精子調(diào)整密度至（50～300）×103/mL為宜，后置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱待用。

（二）臨床操作

控制性超促排卵 實驗組與對照組女方均選擇長方案超促排卵：于啟動周期前次月經(jīng)黃體中期肌注GnRH （達菲林1.33mg），月經(jīng)第3天開始使用Gn促排卵，月經(jīng)第6天起，行陰道B超檢查卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，并以此及時調(diào)整用藥。直至有2～3個主導卵泡直徑在18mm以上時，結(jié)合激素檢測結(jié)果提示卵泡發(fā)育成熟，停用促排卵藥物，于當晚8點注射hCG5000～10000u。注射hCG后34～36h在陰道B超引導下穿刺取卵，記錄取卵數(shù)。

（三）受精及胚胎培養(yǎng)

實驗組與對照組均采用常規(guī)的體外受精。受精后18h觀察原核，出現(xiàn)2個原核和2個極體為正常受精卵，未出現(xiàn)兩原核期（2PN）為受精完全失敗。取卵后培養(yǎng)72h觀察胚胎形態(tài)，將優(yōu)質(zhì)胚胎移植到宮腔內(nèi)。胚胎移植后14d檢測尿或血hCG陽性，移植后4～5周超聲檢查見胎心搏動為臨床妊娠。移植時先選擇常規(guī)受精來源的胚胎，若無常規(guī)受精來源胚胎則移植ICSI受精胚胎。

（四）胚胎按以下評分標準分級

形態(tài)學指標：4’-卵裂球大小均勻，碎片為≤5%；3’-卵裂球大小均勻或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球體積相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2級胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)下列情況，胚胎評級時在形態(tài)學基礎上降一級：（1）授精20h內(nèi)未見到原核，48h證實為延遲受精的胚胎。（2）取卵后48h超過8細胞或72h未超過5細胞。正常受精4、3級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

（五）計算公式

1.受精率=正常受精卵數(shù)/卵-冠-丘復合體數(shù)×l00%。

2.優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵數(shù)×l00%。

3.著床率= B超觀察到的妊娠囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

4.臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×l00%。

5.生化妊娠率= 生化妊娠周期數(shù)/妊娠周期數(shù)。

6.流產(chǎn)率= 孕28周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)。

7.早產(chǎn)率= ART受試者在妊娠滿28周至不滿37周期間分娩周期數(shù)/分娩周期數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用±s表示，比較采用單項方差分析；計數(shù)資料用率（比值）表示，比較應用卡方檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

收集在我院生殖醫(yī)學科就診的132例特發(fā)性少、弱精子癥患者列為實驗組。并將正常生育組50例男性納入對照組。

一、實驗組與對照組一般資料比較

比較實驗組與對照組患者：男、女方年齡、不孕年限、竇卵泡數(shù)、女方基礎 FSH、女方基礎 LH、hCG 日 E2、hCG 日子宮內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

二、實驗組與對照組精液質(zhì)量比較

實驗組與對照組相比，精液參數(shù)中，精液量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。精子濃度、正常形態(tài)率、精子前向運動率（PR,%）、對照組高于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義，精子非前向運動率（NP, %）實驗組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 實驗組與對照組一般資料比較

表2 實驗組與對照組患者基本情況比較

三、實驗組與對照組精子功能的比較

實驗組有10例精子濃度過低，由于無法繼續(xù)進行精子功能試驗，故將此10例患者剔除出去。其中對比兩組精子功能指標，實驗組的頂體酶活性、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率小于對照組，實驗者組DNA碎片、核蛋白組型大于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 實驗組與對照組患者精子功能比較

四、實驗組與對照組體外受精-胚胎移植（IVFET）和胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（ICSI-ET）妊娠結(jié)局的比較

IVF治療者，實驗組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。ICSI治療者，實驗組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5。

六、實驗組與對照組對子代影響

實驗組與對照組相比，兩者的早產(chǎn)率、后代出生體質(zhì)量、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率兩兩比較后顯示無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表6。

表4 實驗組與對照組IVF-ET妊娠結(jié)局的比較

表5 實驗組與對照組ICSI-ET妊娠結(jié)局的比較

表6 實驗組與對照組對子代影響的比較

討 論

當前，特發(fā)性男性不育癥會影響其發(fā)生發(fā)育的遺傳物質(zhì)紊亂成為目前及將來人們關(guān)注的焦點，目前特發(fā)性少弱畸精子癥對精子質(zhì)量精子功能以及輔助生殖結(jié)局的影響研究很少。為了更好地衡量男性生育能力和預測生殖結(jié)局，臨床需要準確地測定精子功能。本研究顯示：與正常人相比，特發(fā)性不育者的精子濃度、總活力以及正常形態(tài)率明顯減少。但是精液量并無顯著性差異，然而對比特發(fā)性少、弱精子癥患者與正常生育組兩組精子功能指標時發(fā)現(xiàn)：特發(fā)性少、弱精子癥患者組的頂體酶活性、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率小于正常生育組，特發(fā)性少、弱精子癥患者組DNA碎片、核蛋白組型大于正常生育組，差異具有統(tǒng)計學意義，這與Muratori等[3,4]研究相似，并且Aktan等[5]研究也發(fā)現(xiàn)特發(fā)性少、弱精子癥患者精子DNA損傷與其高水平的ROS有關(guān)，高水平的ROS容易導致特發(fā)性少、弱精子癥男性精子核蛋白賴氨酸-精氨酸轉(zhuǎn)換障礙，從而導致精子DNA 的易損性增大，或者是高水平的ROS可以直接攻擊精子DNA，引起精子DNA片段斷裂，從而導致精子DNA碎片率增高，精子卵子結(jié)合障礙，最終導致精子功能降低。因此提示：特發(fā)性少、弱精子癥患者除了精液質(zhì)量異常之外有可能合并精子功能異常，因此針對特發(fā)性少、弱精子癥患者在常規(guī)精液分析的基礎上進行精子功能相關(guān)指標檢測，可以揭示一部分特發(fā)性少、弱精子癥患者的病因，并因此可以采取針對性的治療，或者為下一步采取輔助生殖方式的選擇以及治療結(jié)局提供參考。

隨著IVF-ET以及ICSI在男性不育患者中的應用，對于一些特發(fā)性少、弱精子癥男性患者可以通過此類措施而獲得生育。但是這類技術(shù)的應用繞過了自然受精過程中對精子的自然選擇過程，從而對輔助生殖妊娠結(jié)局以及對出生后代是否會產(chǎn)生不良的影響，關(guān)于這方面的問題目前仍不明朗。

為了更準確反映特發(fā)性少、弱精子癥患者對IVF/ICSI-ET結(jié)局的影響，我們將研究對象分為IVF診療組以及ICSI治療組，來分析特發(fā)性少、弱精子癥患者對IVF/ICSI-ET結(jié)局的影響。本研究中，在實行IVF診療組當中特發(fā)性少、弱精子癥患者的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率低于正常男性患者，流產(chǎn)率高于對照組。而在實行ICSI治療組，特發(fā)性少、弱精子癥患者的受精率、卵裂率、著床率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率與正常患者相比，無明顯差異，這與Setti等的研究[6]相似。有研究[7]分析，認為精子DNA碎片的增加對輔助生殖結(jié)局會產(chǎn)生不良影響，它可能會導致精卵結(jié)合障礙從而引起受精率降低，胚胎卵裂率以及胚胎質(zhì)量下降，最終會導致妊娠率降低以及流產(chǎn)率升高。應用ICSI治療的同時結(jié)合糾正不良生活習慣（諸如吸煙、酗酒、服用生殖毒性藥物等），服用抗氧化藥物（如維生素C、維生素E、輔酶Q10等藥物[9]），則可以減少精子DNA異常精子的注射，可能因此會改善輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局[9]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性少、弱精子癥患者組與正常生育組相比，兩者的早產(chǎn)率、后代出生體質(zhì)量、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率兩兩比較后顯示無統(tǒng)計學差異。而Fernández-Gonzalez等[10]通過動物研究發(fā)現(xiàn)雄性精子DNA碎片化增加可以引起早產(chǎn)率增加以及后代癌癥以及先天性畸形的風險增加，這可能是研究的對象不同，或者所采用的研究方法不同所致，這需要今后更大樣本、更系統(tǒng)的采用回顧性研究，以期為臨床上對此類患者進行生育力評估、治療手段的選擇、胚胎植入前遺傳學診斷的選擇和妊娠結(jié)局的預測以及優(yōu)生優(yōu)育工作等提供依據(jù)。

綜上所述，在男性不育診療過程中，對特發(fā)性少、弱精子癥患者進行精子功能檢查有其必要性，充分評估其生育能力，這將有助于其選擇更加合理的生育方式。對于 IVF 治療結(jié)局不良的特發(fā)性少、弱精子癥患者， 實行ICSI 受精可能會改善其助孕治療結(jié)局。然而特發(fā)性男性不育往往涉及多個因素，因此對其研究依然任重道遠。

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