巫靜帆李小霞譚淑娟付有晴楊茜朱鵬遠(yuǎn)馬秋林周光紀(jì)劉彥慧

1廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系（東莞523000）2廣東省東莞市婦幼保健院產(chǎn)科（東莞523000）3廣東省東莞市婦幼保健院耳鼻喉科（東莞523000）4廣東省東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（東莞523000）5東莞市博奧木華基因科技有限公司（東莞523808）

先天性聽力障礙是常見的出生缺陷之一。中國第二次殘疾人抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，聽力及言語殘疾人高達(dá)2780萬，7歲以下聾兒約80萬，且以年均3萬的速度增長[1]，加上遲發(fā)性和藥物性耳聾，每年將新增6-8萬耳聾患者[2]。導(dǎo)致聽力障礙的因素包括遺傳、環(huán)境及兩者共同作用三大類，遺傳性耳聾包含最常見的3個(gè)基因，分別為GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA，但不同地區(qū)突變熱點(diǎn)存在差異。突變位點(diǎn)的差異對(duì)制定有效的預(yù)防、干預(yù)措施具有指導(dǎo)意義。本研究采用遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)東莞戶籍新生兒耳聾基因進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)部分樣本聯(lián)合聽力篩查進(jìn)行了檢測(cè)與分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2016年1月至2017年2月期間，在東莞地區(qū)40家醫(yī)院出生的新生兒，這些新生兒的父母至少有一方是東莞戶籍。

1.2 聽力篩查方法

新生兒于出生2-3天后采用耳聲發(fā)射法(otoacoustic emission,OAE)進(jìn)行初次聽力篩查，初篩不通過者在出生后29-42天進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩采用OAE與自動(dòng)判別聽性腦干誘發(fā)電位法(auto auditory brainstem response,AABR)結(jié)合檢測(cè)。復(fù)篩未通過者，于3月齡進(jìn)行聽力診斷。

1.3 耳聾基因檢測(cè)方法

新生兒出生1-3天內(nèi)采集足跟血2-5滴，血斑直徑8mm，制成干血片。參照干血斑基因組DNA提取標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提取基因組DNA，應(yīng)用晶芯?九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法）對(duì)4個(gè)耳聾基因的9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，包括GJB2（c.235delC， c.299_300delAT， c.176_191del16，c.35delG）、SLC26A4（IVS7-2A＞G，c.2168A＞G）、線粒 體 12SrRNA（m.1555A＞G，m.1494C＞T）和 GJB3（c.538C＞T）。儀器為PCR擴(kuò)增儀（博日TC-96/G/H(b)）、晶芯?SlideWasherTM芯片洗干儀、HybSet基因微陣列芯片雜交盒、晶芯?LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀。試劑與儀器均由博奧生物集團(tuán)有限公司提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，采用SPSS15.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒聽力篩查結(jié)果

在進(jìn)行了耳聾基因與聽力篩查聯(lián)合分析的6242例新生兒中，初篩未通過446例，初篩陽性率7.15%。初篩未通過者在29-42天時(shí)接受復(fù)篩，復(fù)篩未通過103例，復(fù)篩陽性率1.65%。聽力篩查未通過者中有63例進(jìn)行了聽力診斷，最終確診13例耳聾患者，分別為雙耳極重度感音神經(jīng)性耳聾2例，左耳極重度感音神經(jīng)性耳聾/右耳中重度感音神經(jīng)性耳聾1例，右耳極重度耳聾1例，左耳重度感音神經(jīng)性耳聾1例，雙耳中度感音神經(jīng)性耳聾4例，右耳中度耳聾1例，雙耳輕中度耳聾1例，雙耳輕度聽力損失1例，左耳聽反應(yīng)域輕度異常1例。

2.2 新生兒耳聾基因篩查結(jié)果

共完成33810例新生兒檢測(cè)，檢出耳聾基因突變新生兒1129例，其中GJB2c.235delC純合突變3例，雙雜合突變13例，詳見表1。另發(fā)現(xiàn)線粒體基因突變72例，包括線粒體DNA均質(zhì)突變49例，異質(zhì)突變23例。

以等位基因計(jì)算，共發(fā)現(xiàn)突變等位基因1145個(gè)，突變攜帶率約為3.39%（1145/33810），其中GJB2突變攜帶率約為1.96%（661/33810），SLC26A4突變攜帶率約為1.08%（364/33810），線粒體12SrRNA突變攜帶率約為0.22%（74/33810），GJB3突變攜帶率約為0.14%（46/33810），詳見表2。在進(jìn)行檢測(cè)的9個(gè)位點(diǎn)中，排在前五位的突變位點(diǎn)依次 是 c.235delC、IVS7-2A＞G、c.299_300delAT、m.1555A＞G、及c.2168A＞G。

2.3 新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查結(jié)果

6242 例新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查結(jié)果顯示，基因篩查通過的5937例新生兒中，聽力篩查通過5855例，未通過率1.38%，基因篩查未通過的305例新生兒中，聽力篩查通過284例，未通過率6.89%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=54.153，P＜0.01)。

305 例基因篩查未通過新生兒中有GJB2基因突變162例，包括c.235delC雜合突變140例、c.299_300delAT雜合突變17例、c.176_197del雜合突變2例、c.235delC純合突變3例，其中純合突變有3例沒有通過聽力篩查，雜合突變有15例沒有通過聽力篩查，未通過率11.11%；SLC26A4基因突變有59例，其中IVS7-2A＞G雜合突變52例，c.2168A＞G雜合突變7例，有1例未通過聽力篩查，未通過率1.69%；m.1555A＞G突變有40例，其中均質(zhì)突變28例，異質(zhì)突變12例，全部通過聽力篩查；GJB3基因的c.538C＞T雜合突變有31例，全部通過聽力篩查。13例雙雜合突變中有2例c.235delCIVS7-2A＞G未通過聽力篩查，未通過率15.38%。聽力篩查未通過者中有63例進(jìn)行了聽力診斷，最終確診13例耳聾患者，其中有4例基因未通過，分別為c.235delC純合突變3例和c.235delCIVS7-2A＞G雙雜合突變1例，其余9例均未發(fā)現(xiàn)檢測(cè)范圍內(nèi)的基因突變。

3 討論

表1 純合及雙雜合突變病例情況Table 1 Cases of homozygous and heterozygous in various genes

導(dǎo)致聽力障礙的因素較為復(fù)雜，有遺傳因素、環(huán)境因素或者兩者共同作用，其中遺傳因素約占50%～60%[3]，而由此導(dǎo)致的新生兒聽力障礙目前無理想治療措施，但可控可防，即通過對(duì)攜帶耳聾基因突變的新生兒進(jìn)行預(yù)防指導(dǎo)，可避免或推遲耳聾的發(fā)生，但耳聾基因及突變譜存在地域和種族差異[4-5]，因此，基因檢測(cè)對(duì)降低耳聾的發(fā)生率具有重要意義。本次研究共完成東莞戶籍新生兒檢測(cè)33810例，檢出攜帶者1129例，約占總數(shù)的3.34%，4個(gè)基因9個(gè)突變熱點(diǎn)共檢出1145個(gè)，突變率約為3.39%，該數(shù)據(jù)低于文獻(xiàn)報(bào)道的4.17%～5.15%[6-8，10-11]。

表2 4種基因9個(gè)位點(diǎn)的突變攜帶率Table 2 The carrie rate of nine hot spots

表2顯示，4個(gè)基因突變檢出率從高到低依次為GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA和GJB3，基因突變位點(diǎn)頻率前5位依次為c.235delC、IVS7-2A＞G、c.299_300delAT、m.1555A＞G及c.2168A＞G，與文獻(xiàn)相似[7,9,10]。但具有特點(diǎn)，其中共檢出GJB2基因突變者658例（58.28%），該基因的攜帶率約為1.96%，其中c.235delC約占突變數(shù)的86.84%，高于文獻(xiàn)報(bào)道[9,12]，而c.299_300delAT和c.176_191del16突變率顯著低于文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，提示東莞地區(qū)戶籍人群以c.235delC為突變熱點(diǎn)。SLC26A4是僅次于GJB2的感音神經(jīng)性耳聾遺傳基因，是遲發(fā)性耳聾發(fā)生的重要基因，本次檢出364例突變攜帶者，占總突變?nèi)巳旱?2.24%，突變攜帶率約為1.08%，低于文獻(xiàn)報(bào)道的1.50%～2.07%[6,7,10]。GJB3基因突變共檢出46例，占總突變?nèi)巳旱?.07%，突變攜帶率約為0.14%，低于文獻(xiàn)報(bào)道的0.295%～0.32%[6-7]。東莞戶籍新生兒耳聾基因突變的這些獨(dú)特性可能與以下原因有關(guān)：首先是地域性，東莞地處珠江口東岸，是嶺南文化發(fā)源地，同時(shí)也是我國改革開放的先行地，是我國移民第二多城市，僅次于深圳，總?cè)丝?000萬左右，但戶籍人口僅占約20%，本研究為盡可能保證遺傳背景的一致性，選擇夫妻雙方或一方為東莞戶籍的新生兒作為檢測(cè)對(duì)象，但并非均為土著居民，遺傳背景并不完全一致。其次，本次為大規(guī)模樣本研究，而文獻(xiàn)報(bào)道均為小樣本研究。最后，本次僅對(duì)導(dǎo)致耳聾的4個(gè)基因9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，而與聽力相關(guān)基因突變位點(diǎn)高達(dá)100余個(gè)，因此，作者無法排除本地區(qū)是否存在其他基因突變的可能性。

另外，從表1中作者發(fā)現(xiàn)，耳聾基因也具有遺傳異質(zhì)性。表1中7例GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因的IVS7-2A＞G雙重雜合突變，在未通過聽力篩查的2例中，僅有1例診斷為左耳極重度感音神經(jīng)性耳聾，右耳中重度感音神經(jīng)性耳聾，并佩戴了助聽器，而另1例卻無聽力障礙臨床癥狀，此例雖然未通過首次聽力篩查，但經(jīng)6個(gè)月后的隨訪證實(shí)對(duì)聲音反應(yīng)良好，其他5例均通過聽力篩查。其可能的原因是：1.致聾的患兒攜帶有其它位點(diǎn)突變；2.受環(huán)境影響致聾[8,13-16]。

本研究顯示，6242例進(jìn)行聯(lián)合篩查的新生兒中有305例未通過基因檢測(cè)，聽力篩查未通過21例，漏檢284例，大部分基因攜帶者、藥物性耳聾患兒均通過了聽力篩查，但在其成長過程中受外界環(huán)境影響可導(dǎo)致聽力損傷甚至終生耳聾，比如線粒體DNA12SrRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，其子代均為突變基因攜帶者，使用氨基糖苷類抗生素可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的聽力殘疾[17-19]，又如GJB3基因突變可引起常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合征耳聾，與高頻聽力下降有關(guān)[20,21]，且有GJB2/GJB3雙雜合突變致病的模式[22]，故需定期進(jìn)行聽力監(jiān)測(cè)。進(jìn)行基因檢測(cè)不僅可以明確病因，還可以有針對(duì)性地對(duì)高危人群進(jìn)行用藥指導(dǎo)、行為指導(dǎo)以及婚育指導(dǎo)，可見耳聾基因篩查是早期發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾和藥物性耳聾的有效手段。但由于基因篩查無法發(fā)現(xiàn)由耳部結(jié)構(gòu)畸形、分泌性中耳炎等非遺傳因素導(dǎo)致的耳聾，同時(shí)由于檢測(cè)位點(diǎn)的局限性，也會(huì)造成部分患者的漏診，本文中有未通過聽力篩查的新生兒103例，其中僅21例攜帶致病突變，而確診的13例患者有9例未檢測(cè)出基因突變；可見兩種方法具有互補(bǔ)性。

耳聾基因篩查是早期發(fā)現(xiàn)新生兒聽力障礙的重要輔助檢測(cè)方法，本次研究基本明確了東莞地區(qū)遺傳性耳聾的突變分布情況。另外，聽力篩查和耳聾基因篩查具有很好的互補(bǔ)性，通過聯(lián)合篩查能夠從分子水平發(fā)現(xiàn)有可能存在聽力損傷的新生兒，對(duì)藥物性耳聾高?；純旱慕K生用藥提供指導(dǎo)，減少遲發(fā)性耳聾高危新生兒的發(fā)病率和降低患兒的聽力損失嚴(yán)重程度，并能及時(shí)對(duì)患兒聽力狀況作出評(píng)估，有助于降低耳聾出生缺陷率；對(duì)遺傳性耳聾高?；純哼M(jìn)行定期聽力檢查，為早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測(cè)耳聾的發(fā)生及制定干預(yù)措施提供了有利的參考，對(duì)降低耳聾發(fā)病率有重要意義[23-24]。

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