于曉宇 林妘 許軍 楊濤 吳皓

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

大前庭導(dǎo)水管（Enlarged vestibular aqueduct,EVA）是與兒童感音神經(jīng)性聾相關(guān)的最常見(jiàn)的內(nèi)耳畸形[1]。大部分EVA患者表現(xiàn)為非綜合征型耳聾(DFNB4,OMIM#600791），少部分同時(shí)合并甲狀腺腫大，稱(chēng)Pendred綜合征（Pendred syndrome,PDS,OMIM274600）。研究表明，SLC26A4的雙等位基因突變是導(dǎo)致EVA的主要病因[2,3]。SLC26A4基因有21個(gè)外顯子，編碼含780個(gè)氨基酸的多次跨膜蛋白Pendrin.Pendrin表達(dá)于內(nèi)耳、甲狀腺和腎臟，能夠介導(dǎo) Cl-、I-、OH-、HCO3-等陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[4,5]。至今已報(bào)道有近200種SLC26A4基因的致病突變，其突變譜在不同的地區(qū)和種族中存在差異。例如，SLC26A4基因的熱點(diǎn)突變?cè)诎追N人中為p.L236P,p.T416P和c.1001+1G＞A[6]，在日本和韓國(guó)人中為p.H723R[7,8]，而中國(guó)人群中，c.919-2A＞G突變最常見(jiàn)[9]。同時(shí)，SLC26A4基因突變的檢出率也存在種族差異，據(jù)報(bào)道SLC26A4雙等位突變的檢出率在北美白種人為33%，而在中國(guó)漢族EVA患者中攜帶SLC26A4雙等位突變的占88%。本研究旨在通過(guò)對(duì)中國(guó)華東地區(qū)135例非綜合征性EVA耳聾先證者進(jìn)行SLC26A4基因突變檢測(cè)，進(jìn)一步了解EVA耳聾患者SLC26A4基因突變檢出率和突變譜，為指導(dǎo)臨床基因診斷和遺傳咨詢提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究的135例研究對(duì)象為2009年10月至2017年1月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳科學(xué)或遺傳學(xué)門(mén)診的EVA耳聾患者。所有患者均經(jīng)高分辨率顳骨CT或者磁共振成像(MRI)診斷為EVA，診斷依據(jù)為軸位CT掃描顯示患者前庭總腳至前庭水管外口之間中點(diǎn)的最大管徑寬度＞1.5 mm[10]。對(duì)所有研究對(duì)象均進(jìn)行詳細(xì)的病史詢問(wèn)及體格檢查以排除其他致病因素造成的聽(tīng)力損失和綜合征性耳聾。聽(tīng)力學(xué)檢查根據(jù)患者的年齡和配合程度選擇純音測(cè)聽(tīng)、行為測(cè)聽(tīng)或聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)(Auditory brainstem response,ABR)檢測(cè)。聽(tīng)力損失程度的分級(jí)根據(jù)2003年Van camp等[11]歐洲工作組倡導(dǎo)的遺傳性耳聾的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：輕度（20～ 40 dB HL）、中度（41～70 dB HL）、重度（71～95 dB HL）及極重度（＞95 dB HL）。本研究通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均被詳細(xì)告知權(quán)利和風(fēng)險(xiǎn)，并由本人或法定監(jiān)護(hù)人簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

2 方法

2.1 DNA提取

使用天根生化科技（北京）有限公司的基因組DNA提取試劑盒，參照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)從全血中提取基因組DNA，并利用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)所提DNA進(jìn)行含量和純度檢測(cè)。

2.2 巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)和Sanger測(cè)序

針對(duì)SLC26A4基因的編碼區(qū)及側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)巢式PCR引物進(jìn)行分段擴(kuò)增，根據(jù)引物參數(shù)確定最佳反應(yīng)條件。PCR所使用引物序列、試劑、反應(yīng)條件和反應(yīng)體系詳見(jiàn)柴永川等[12]。所得巢式PCR產(chǎn)物直接由上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，并使用Sequencher 4.9序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的秩和檢驗(yàn)對(duì)攜帶不同數(shù)量SLC26A4突變的EVA患者的聽(tīng)力損失程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

本研究共收集到符合EVA診斷標(biāo)準(zhǔn)的先證者135例，其中男性67例，女性68例，患者年齡1月～32歲，中位年齡4歲。SLC26A4基因編碼區(qū)突變檢測(cè)在135例EVA耳聾患者中共檢測(cè)出存在于210等位基因上的51種突變，其中，最常見(jiàn)的是剪切位點(diǎn)突變c.919-2A＞G，占總檢出突變的50%(105/210)，其次是錯(cuò)義突變p.H723R，占10.48%(22/210)。所有先證者中，74.07%（100/135）的患者攜帶有SLC26A4雙等位基因突變，7.41%的（10/135）的先患者攜帶SLC26A4單等位基因突變，而18.52%（25/135）的患者未檢測(cè)到任何SLC26A4基因突變。135例患者的SLC26A4基因突變情況詳見(jiàn)表1。聽(tīng)力學(xué)資料顯示，攜帶有SLC26A4雙等位基因突變、單等位基因突變和無(wú)SLC26A4基因突變的3組先證者的聽(tīng)力損失程度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表2)。

表1 135例EVA耳聾患者SLC26A4基因外顯子突變篩查結(jié)果Table1 SLC26A4 coding region mutations in 135 probands with non-syndromic EVA

Allele 1 p.L676Q p.M147V p.N392Y p.N392Y p.Q446X p.R409C p.T410M p.T410M V659L c.1548insC c.1707+5G＞A c.414delT c.915-916insG c.915-916insG c.919-2A＞G c.915insG p.H723R p.S532R p.V163I p.V412I none Total Allele 2 p.H723R p.H723R p.I529S p.S532R p.H723R p.H723R p.D661Y p.H723R N392Y+K77I p.N392Y p.V650D p.N392Y p.M147V c.1707+5G＞A none none none none none none none Number of subjects(%)1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）5（3.70）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）25（18.52）135（100）

表2 SLC26A4雙等位基因突變、單等位基因突變及無(wú)SLC26A4基因突變患者的聽(tīng)力損失程度Table 2 Severity of hearing loss in subjects with two,one or zero SLC26A4 mutations

4 討論

SLC26A4是EVA耳聾患者主要的致病基因。自從1997年被鑒定以來(lái)，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近200種SLC26A4致病突變類(lèi)型，但已報(bào)道的EVA耳聾患者SLC26A4基因的突變率和熱點(diǎn)突變存在著明顯的地域和種族差異。本文通過(guò)對(duì)華東地區(qū)135例散發(fā)EVA耳聾先證者的SLC26A4基因篩查研究共檢測(cè)出51種突變，其中最常見(jiàn)的是剪切位點(diǎn)突變c.919-2A＞G和錯(cuò)義突變p.H723R，分別占總檢出突變的50%和10.48%，與之前華北地區(qū)及臺(tái)灣地區(qū)的報(bào)道一致[2,9]。與之前報(bào)道不同的是EVA耳聾先證者中未檢出SLC26A4雙等位基因突變的患者比例。Wang等[9]報(bào)道的非SLC26A4雙等位基因突變的EVA耳聾患者比例為11.6%，包含9.5%SLC26A4單等位基因突變的病例和2.1%的未檢出SLC26A4等位基因突變的病例；Chen等[13]報(bào)道的中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)EVA耳聾患者中，SLC26A4單等位基因突變的病例占24%，未見(jiàn)SLC26A4等位基因突變的病例占14%，而本研究顯示華東地區(qū)未檢出SLC26A4突變的EVA患者比例較高，存在這種差異可能有兩個(gè)原因：1.樣本人群的地域和民族差異。中國(guó)是一個(gè)地域廣闊的多民族國(guó)家，南北方之間及不同民族之間可能存在著一定的遺傳差異。2.樣本中所含家族性EVA耳聾患者的比例不同，本研究中有EVA家族史的患者僅有4例，低于之前報(bào)道中有EVA家族史的患者例數(shù)。

EVA耳聾作為隱性遺傳疾病，有一部分患者在主要致病基因SLC26A4編碼區(qū)未檢出雙等位基因突變，提示可能存在其他遺傳因素在EVA耳聾中起著重要作用，如SLC26A4基因大片段缺失、內(nèi)含子突變、SLC26A4基因調(diào)控序列突變以及SLC26A4基因之外其它致病基因的影響。以上假設(shè)已在部分研究中得到證實(shí)，例如Pique等[14]利用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)發(fā)現(xiàn)1例（1/107）攜帶SLC26A4單雜合突變的患者存在SLC26A4基因的雜合大片段缺失g.8091T-22145Cdel突變；Yang等研究證實(shí)，SLC26A4基因的啟動(dòng)子突變以及轉(zhuǎn)錄因子FOXI1和內(nèi)向整流鉀例子通道KCNJ10均能以SLC26A4/FOXI1或SLC26A4/KCNJ10雙基因雜合突變形式導(dǎo)致EVA耳聾的發(fā)生[15,16]。本研究未能對(duì)SLC26A4基因啟動(dòng)子、大片段缺失以及FOXI1、KCNJ10基因進(jìn)行檢測(cè)，但之前研究提示中國(guó)漢族人群上述基因突變率很低[17]。盡管如此，對(duì)于未能檢測(cè)出SLC26A4雙等位基因突變的EVA患者仍需考慮這些基因致病的可能性，同時(shí)也有必要進(jìn)一步探索與EVA相關(guān)的其他未知致病基因。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)華東地區(qū)135例非綜合征性EVA耳聾先證者SLC26A4基因篩查證實(shí)SLC26A4基因的熱點(diǎn)突變方式為c.919-2A＞G和p.H723R，對(duì)臨床EVA耳聾的基因篩查和診斷具有一定參考價(jià)值。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)EVA耳聾先證者中非SLC26A4雙等位基因突變的患者比例較高，并且這部分患者的聽(tīng)力損失程度與SLC26A4雙等位基因突變的患者相比沒(méi)有顯著差異，提示可能存在其他致病因子在EVA綜合征耳聾的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。未來(lái)研究需要進(jìn)一步探索導(dǎo)致EVA的新致病因素，促使建立在基因診斷基礎(chǔ)上的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷更加準(zhǔn)確和完善。

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