周童，張遠鵬，張啟文

山東省萊蕪市人民醫(yī)院普外科，山東萊蕪2711000

胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有惡性程度高和預后差等特點[1]。該病的發(fā)生、發(fā)展涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活等復雜過程，因此，從分子水平研究該病的發(fā)生、發(fā)展機制，對臨床治療有重要的意義[2]。腫瘤相關鈣信號傳導因子 2（tumor-associated calcium signal transducer 2，TROP2）是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關的基因，是一種可以調節(jié)腫瘤細胞生長的信號傳導分子[3]。在正常的組織中TROP2不表達或低表達，而在肺癌和食管癌等腫瘤細胞中高表達，其表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后等相關，因此TROP2可以作為一種預測癌癥預后的獨立因子[4-5]。有研究指出，在一些腫瘤細胞中，如大腸癌和乳腺癌等，抑制TROP2基因表達，可以降低癌細胞的侵襲和遷移能力[6-7]，然而TROP2基因在胰腺癌中的作用機制尚不清楚。本研究通過RNA干擾技術抑制胰腺癌細胞中TROP2基因的表達，觀察細胞的增殖和凋亡情況，進一步研究其作用機制，為研究胰腺癌的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2016年6月至2017年7月山東省萊蕪市人民醫(yī)院保存的胰腺癌組織和相應的癌旁組織（距離腫瘤邊緣1～2 cm）各46例。所有患者的病歷資料完整且術前均未行化療和放療，所有組織均經(jīng)病理學檢查確診，所有患者及家屬均對本研究知情同意。46例標本所屬患者中，男24例，女22例；年齡為35～71歲，平均為（54.2±8.5）歲；組織病理學分級按照Kloppel標準分為高分化腺癌11例，中分化腺癌25例，低分化腺癌10例；臨床分期按照國際抗癌協(xié)會（UICC）1992年標準分為Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期26例；有淋巴結轉移27例，無淋巴結轉移19例。本研究經(jīng)山東省萊蕪市人民醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑與儀器

人胰腺癌PANC-1細胞購于中國科學院細胞庫。胰酶、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，TROP2、cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1抗體購于美國Abcam公司，CCK8細胞增殖試劑盒、BCA試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒均購于碧云天生物技術研究所，熒光定量試劑盒和反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，酶標儀購于美國Bio-Rad公司，流式細胞儀購于美國Becton Dickinson公司。

1.3 檢測方法

1.3.1TROP 2基因mRNA表達的檢測方法利用Trizol法提取胰腺癌和相應的癌旁組織中的總RNA。根據(jù)逆轉錄試劑盒的操作說明，將總RNA反轉錄為cDNA。利用Primer premier 6.0引物設計軟件設計基因TROP2及內參基因GAPDH的逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物，每個樣品設置6個重復孔，通過實時熒光定量PCR儀對TROP2和GAPDH基因進行擴增。引物序列如下：①TROP2引物序列，上游引物為5'-CCTCATCGCCGTCATCGT-3'，下游引物為5'-CGGTTCCTTTCTCAACTCCC-3'；②GAPDH引物序列，上游引物為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR的擴增條件為：95℃下5 min；95 ℃下30 s；60 ℃下15 s，72 ℃下20 s，共40個循環(huán)。72℃延伸15 min，4℃保存。根據(jù)熒光定量PCR所得循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值，利用2-△△Ct法計算TROP2的mRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與轉染的方法人胰腺癌PANC-1細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，取生長對數(shù)期的細胞用于轉染。轉染前24 h，將傳代培養(yǎng)后的細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入 2 ml的 PANC-1細胞（濃度為 1×106/孔）。PANC-1細胞生長融合度＞80%時進行轉染，轉染按照美國Invitrogen公司Lipofectamine TM 2000轉染說明進行操作。轉染分為對照組（不經(jīng)任何處理）、陰性對照組（轉染NC-siRNA）和TROP2沉默組（轉染TROP2-siRNA）。

1.3.3 TROP 2、cleaved caspase 3、NOTCH 1、HES 1蛋白表達的檢測方法將對照組、陰性對照組和TROP2沉默組的細胞，轉染48 h，加入RAPI細胞裂解液，提取細胞中的蛋白。取少量的蛋白樣品，利用BCA試劑盒對蛋白進行定量分析。在蛋白樣品與上樣緩沖Buffer充分混勻后，煮沸變性10 min。取30 μg的變性蛋白，依次進行SDSPAGE分離、PVDF轉膜、5%的脫脂奶粉封閉，孵育TROP2、cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1作為一抗（均1∶1000稀釋），4℃過夜，TBST洗滌；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶1000稀釋），37℃孵育2 h。增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，顯影，定影。實驗重復3次。

1.3.4 細胞增殖的檢測方法將對照組、陰性對照組和TROP2沉默組轉染后的細胞，以1×104/ml的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設置6個復孔，收集細胞。每孔加入CCK8試劑10 μl，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，收集細胞。利用空白對照孔調零，選擇酶標儀上450 nm處測定各孔的吸光度（A值），重復3次。細胞的增殖率=轉染組細胞A值/對照組細胞A值×100%。

1.3.5 細胞凋亡的檢測方法采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡。取對照組、陰性對照組和TROP2沉默組轉染后培養(yǎng)48 h的細胞，加入預冷的PBS洗滌細胞，再加入300 μl結合緩沖液懸浮細胞，細胞濃度調整為 1×106/ml，取 100 μl的細胞懸液至流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻后室溫避光孵育15 min，反應管中再加入400 μl的PBS。1 h內通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織中TROP 2基因mRNA表達

采用RT-PCR法檢測TROP2基因在胰腺癌組織和癌旁組織中的mRNA表達，TROP2基因在胰腺癌組織中的mRNA相對表達量為（5.987±0.583），明顯高于癌旁組織的（0.953±0.049），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（圖1）

圖1 胰腺癌中TROP 2基因的mRNA表達

2.2 轉染TROP 2-siRNA后PANC- 1細胞中TROP 2蛋白表達

TROP2-siRNA轉染PANC-1細胞48 h后，采用蛋白質印跡法檢測對照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組TROP2蛋白表達，分別為（0.355±0.032）、（0.350±0.036）和（0.148±0.024），3組比較，差異有明顯統(tǒng)計學意義（F=43.342，P＜0.01）；TROP2-siRNA組TROP2蛋白表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而NC-siRNA組TROP2蛋白表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 轉染TROP 2-siRNA后的PANC- 1細胞中TROP 2的蛋白表達

2.3 轉染TROP 2-siRNA降低PANC- 1細胞增殖

對照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組細胞的平均存活率分別為（100±2.12）%、（98.88±3.23）%、（67.45±4.32）%，3組比較，差異有明顯統(tǒng)計學意義（F=91.484，P＜0.01）；TROP2-siRNA組細胞的存活率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而NC-siRNA組細胞的存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖3）

圖3 轉染TROP 2-siRNA對PANC- 1細胞增殖的影響

2.4 轉染TROP 2-siRNA促進PANC- 1細胞凋亡

對照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組細胞的凋亡率分別為（1.83±0.54）%、（1.85±0.51）%和（17.21±1.36）%，3組比較，差異有明顯統(tǒng)計學意義（F=295.137，P＜0.01）；TROP2-siRNA組細胞的凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而NC-siRNA組細胞的凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖4）

圖4 轉染TROP 2-siRNA對PANC- 1細胞凋亡的影響

2.5 轉染TROP 2-siRNA對PANC- 1細胞cleaved caspase 3、NOTCH 1、HES 1蛋白表達的影響

采用蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白cleaved caspase 3和NOTCH1信號通路相關蛋白NOTCH1、HES1的表達，對照組、NC-siRNA組和TROP2-siRNA組cleaved caspase 3蛋白表達分別為（0.03±0.01）、（0.03±0.01）和（0.13±0.02），NOTCH1的蛋白表達分別為（0.54±0.04）、（0.53±0.04）和（0.25±0.02），HES1的蛋白表達分別為（0.24±0.03）、（0.25±0.03）和（0.09±0.02），3組cleaved caspase 3、NOTCH1和HES1蛋白表達比較，差異均有明顯統(tǒng)計 學 意 義（F=47.45、64.58、44.84，P＜ 0.01）；TROP2-siRNA組cleaved caspase 3蛋白表達明顯高于對照組，NOTCH1、HES1蛋白表達明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而NC-siRNA組cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1蛋白表達與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖5）

圖5 轉染TROP 2-siRNA對PANC- 1細胞cleavedcaspa se 3、NOTCH 1、HES 1蛋白表達的影響

3 討論

惡性腫瘤具有無限、快速的增殖能力，嚴重地威脅人類的生命健康，其發(fā)生的原因包括抑癌基因、原癌基因和DNA損傷修復基因等表觀遺傳學的改變或突變。目前，多種腫瘤分子標志物在腫瘤的發(fā)生過程中的作用受到人們廣泛地關注[8-9]。TROP2屬于TACSTD家族，又稱為EGP-1、TACSTD2、GA733-1，定位于人類染色體1p32，是一種單次跨膜表面的糖蛋白。近年，研究者通過基因表達串聯(lián)分析、基因芯片和免疫組化等方法，發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中均有TROP2基因的高表達，其表達與遠處轉移及預后不良有密切的關系[10-13]。研究顯示，卵巢癌組織中TROP2基因高表達，其表達程度與腹腔積液轉移、淋巴結轉移及總生存期等有密切的關系[14-15]。宮頸癌組織中TROP2基因的高表達與臨床分期、淋巴結轉移、組織學分化程度及浸潤深度等有密切的關系[16-17]。這些研究結果說明，TROP2基因的高表達對惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉移和預后等有重要的影響；深入研究該基因在腫瘤中的生物學作用，尋找其作用機制，TROP2有望成為潛在的治療腫瘤的分子靶點。

研究顯示，抑制胃癌和前列腺癌組織中TROP2基因的表達，可以降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[18-19]；抑制肺腺癌組織中TROP2基因的表達，可以降低腫瘤細胞的增殖能力，促進細胞凋亡[20]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA介導的可以使基因在轉錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，有高度的特異性和有效性，是研究基因功能的有效途徑[21-22]。本研究通過RNA干擾技術沉默胰腺癌組織中TROP2基因的表達，檢測細胞的增殖和凋亡情況，結果顯示，抑制TROP2基因表達后細胞的增殖明顯降低，細胞凋亡增加。

細胞凋亡受到多種因素的調控，Caspase家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。caspase 3是Caspase家族中的關鍵酶和效應蛋白，處在caspase級聯(lián)反應的下游，受到凋亡刺激后被激活，活化后可以使細胞凋亡進入不可逆階段[23]，目前已在胰腺癌和胃癌等多種腫瘤細胞中得到證實[24-25]。NOTCH信號通路是一條進化保守途徑，參與細胞的增殖、凋亡、分化和機體發(fā)育等的調節(jié)過程，由NOTCH受體及配體、下游效應物、DNA結合蛋白組成，可以從多個方面對細胞的增殖、凋亡和機體發(fā)育等進行調控，影響細胞命運[26]。NOTCH1是其中的一個受體，其異常表達可以直接或間接地誘導腫瘤發(fā)生[27]。研究顯示，抑制胰腺癌和肺癌中NOTCH1信號通路，可以減緩腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[28-29]。HES1是NOTCH1信號通路下游最重要的靶基因，HES1基因表達與否是NOTCH1信號通路是否被激活的標志[30]。本研究在抑制TROP2基因表達后檢測cleaved caspase 3、NOTCH1、HES1蛋白表達，顯示抑制TROP2基因表達后cleaved caspase 3蛋白表達明顯上調，NOTCH1、HES1蛋白表達明顯下調。

綜上所述，抑制胰腺癌中TROP2基因的表達，可以阻斷NOTCH1信號通路，降低癌細胞的增殖能力，促進細胞凋亡。本研究為胰腺癌分子治療途徑的研究提供了一定的理論基礎。

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