楚廣民，張建波，孫淼淼

鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，鄭州4500080

膀胱癌是最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率在歐美男性腫瘤中居于第4位，具有復發(fā)率高、惡性程度高的特點。其中，浸潤性膀胱癌的惡性程度極高，5年生存率低于50%[1]，目前的治療手段并不能有效地提高患者的5年生存率，因此探尋新的治療方法尤為重要。SOX9屬于SRY相關基因家族，該家族能夠編碼一系列轉(zhuǎn)錄因子，其共同特點是具有保守的HMG-box DNA結(jié)合域。有研究表明，SOX9基因參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。目前，干擾SOX9基因表達對膀胱癌細胞生物學特性的影響尚未見報道。本研究采用干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）作用于膀胱癌EJ細胞株，檢測其對EJ細胞增殖與凋亡的影響，并進一步探索其潛在的作用機制，旨在為膀胱癌的治療提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

膀胱癌EJ細胞株購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。培養(yǎng)基為RPIM-1640，購自Hyclone公司，含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素及100 IU/ml鏈霉素。

1.2 儀器和試劑

Multiskan MK3酶標儀購自美國Thermo公司，DMi8-電動熒光顯微鏡購自德國徠卡公司。Edu細胞增殖試劑盒、Hoechst 33342細胞凋亡試劑盒購自聯(lián)科生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自日本東仁化工公司，蛋白抗體AKT、p-AKT、PTEN及β-actin購自美國Santa cruz公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 siRNA細胞轉(zhuǎn)染SOX9siRNA有效序列：上游 5'-AGGAAGCTCGCGGACCAGTAC-3'，下游5'-GGTGGTCCTTCTTGTGCTGCAC-3'；對 照 組siRNA序列：上游5'-UCCACUGTACCUGGCUCGATT-3'，下 游 5'-CGUGCAAGGUCCGAGAAT-3'。將EJ細胞混懸液接種于細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，采用INTERFERINGTM轉(zhuǎn)染試劑，按說明書進行操作，將siRNA以50 nmol/L的終濃度加入EJ細胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染48 h后，細胞用于后續(xù)功能實驗。

1.3.2 CCK- 8細胞活性檢測將EJ細胞混懸液以2×104/孔接種于96孔板中。于培養(yǎng)箱中孵育72 h，然后將 100 μl細胞培養(yǎng)基和 10 μl CCK-8 試劑混勻后加入各孔中。再將96孔板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，采用酶標儀測定光密度（OD）值，設定激發(fā)波長為450 nm。實驗重復3次。

1.3.3 Edu細胞熒光染色法將處于對數(shù)生長期的EJ細胞以3×103/孔接種于96孔板中，用細胞培養(yǎng)基按1000∶1的比例稀釋Edu溶液，制備50 μmol/L的Edu培養(yǎng)基100 ml。每孔加入100 μl稀釋后的Edu，孵育1 h，棄去培養(yǎng)基，之后用PBS清洗細胞2次，每次5 min；每孔加入100 μl 4%多聚甲醛，室溫孵育30 min后，每孔加入2 mg/ml甘氨酸0.5 ml，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液；PBS清洗5 min，0.5%Triton X-100破膜 10 min，PBS清洗 5 min。DAPI染色完成后，熒光顯微鏡觀察。熒光顯微鏡（×100）下隨機選取5個視野，計數(shù)總細胞數(shù)和Edu染色陽性細胞數(shù)，細胞相對增殖率=（SOX9沉默組Edu染色陽性細胞數(shù)/SOX9沉默組總細胞數(shù)）（/對照組Edu染色陽性細胞數(shù)/對照組總細胞數(shù)）×100%。實驗重復3次。

1.3.4 Hoechst 33342細胞染色將已制備好的細胞爬片用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，然后于4%多聚甲醛中固定1 h；PBS清洗3遍，將玻片浸泡在裝有Hoechst 33342染液的染色缸中，避光10 min。在340 nm的激發(fā)光下觀察，于熒光顯微鏡（×100）下隨機選取5個視野計數(shù)?；罴毎蕪浬⒕鶆驘晒猓蛲黾毎嘶蚣毎|(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果觀察到3個或3個以上的DNA熒光碎片即可認為是凋亡細胞。實驗重復3次。

1.3.5 劃痕愈合實驗將各組貼壁生長的細胞制備為細胞混懸液后，接種于12孔板中，每孔5000個細胞，各孔添加2 ml細胞培養(yǎng)液并置入孵箱孵育24 h。然后用1 ml移液槍頭垂直孔板制造細胞劃痕并拍照，記錄劃痕寬度。再將細胞置入孵箱孵育48 h后取出拍照，記錄劃痕寬度。相對劃痕愈合比例（%）=（各組48 h后劃痕寬度/各組初始劃痕寬度）（/對照組48 h后劃痕寬度/對照組初始劃痕寬度）×100%。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）實驗制備RIPA細胞裂解液，裂解細胞。取等量蛋白樣品，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入特異性一抗（PTEN、AKT及p-AKT），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光和曝光顯影。其中一抗有效濃度為（1∶2000）～（1∶3000），對照為β-actin。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件-對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX 9基因沉默對EJ細胞株活性的影響

將SOX9siRNA轉(zhuǎn)染EJ細胞，干擾SOX9mRNA的表達，以非特異性siRNA轉(zhuǎn)染EJ細胞為對照組，采用qRT-PCR方法檢測干擾效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組的SOX9mRNA表達水平為（100.0±0.5）%，明顯高于SOX9沉默組的（14.2±1.3）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=106.680，P＜0.01）。轉(zhuǎn)染48 h后，對照組細胞在450 nm激發(fā)光下的OD值為（2.8±0.2），明顯高于SOX9沉默組的（1.1±0.2），差異有統(tǒng)計學意義（t=10.410，P＜0.01）；轉(zhuǎn)染72 h后，對照組細胞在450 nm激發(fā)光下的OD值為（4.0±0.3），明顯高于SOX9沉默組的（2.3±0.2），差異有統(tǒng)計學意義（t=8.167，P＜0.01）。（圖1）

圖1 對照組和SOX 9沉默組細胞的吸光度

2.2 SOX 9基因沉默對EJ細胞增殖的影響

Edu細胞熒光染色結(jié)果（圖2）顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，對照組的細胞相對增殖率為（100.0±2.3）%，明顯高于SOX9沉默組的（42.2±3.2）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=25.404，P＜0.01）。

圖2 Edu細胞熒光染色結(jié)果圖

2.3 SOX 9基因沉默對EJ細胞凋亡的影響

Hoechst 33342免疫熒光染色結(jié)果（圖3）表明，對照組的細胞凋亡率為（7.2±1.2）%，明顯低于SOX9沉默組的（33.2±2.4）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.783，P＜0.01）。

圖3 Hoechst 33342免疫熒光染色結(jié)果圖

2.4 SOX 9基因沉默對EJ細胞遷移的影響

劃痕愈合實驗結(jié)果（圖4）顯示，對照組的相對劃痕愈合比例為（100.0±1.9）%，明顯高于SOX9沉默組的（56.6±4.3）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=15.990，P＜0.01）。

圖4 劃痕愈合實驗結(jié)果圖

2.5 SOX 9基因沉默對EJ細胞PTEN/AKT通路蛋白表達的影響

SOX9siRNA轉(zhuǎn)染EJ細胞1 h后，采用Western Blot檢測PTEN、AKT及p-AKT蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，SOX9沉默組的PTEN蛋白表達水平高于對照組，p-AKT蛋白表達水平低于對照組。（圖5）

圖5 SOX 9基因沉默對EJ細胞PTEN/AKT通路蛋白表達的影響

3 討論

SOX基因超家族參與性別決定、胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨形成、血細胞生成、晶狀體發(fā)育等多種早期胚胎發(fā)育過程，同時有研究報道該基因家族在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起到重要作用[3]。有研究表明，SOX9基因的異常表達可導致結(jié)直腸癌[4]。SOX9在肺癌和胰腺癌組織中表達豐富[5-6]，并且與乳腺癌的預后密切相關[7]。然而，SOX9與膀胱癌的關系目前尚未知曉。本實驗結(jié)果表明，沉默SOX9基因表達后膀胱癌EJ細胞的活性明顯下降。為進一步了解其對細胞增殖和凋亡的影響，本研究分別采用Hoechst 33342細胞染色與Edu細胞熒光染色檢測EJ細胞的增殖和凋亡情況。結(jié)果表明，沉默SOX9基因表達后，EJ細胞的增殖明顯被抑制，同時，細胞凋亡率明顯增加。膀胱癌細胞具有較強的轉(zhuǎn)移能力，本研究通過劃痕愈合實驗，檢測沉默SOX9基因表達后EJ細胞轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果表明，沉默SOX9基因表達后，EJ細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。

研究表明，PTEN/AKT信號通路廣泛參與腫瘤細胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移等多個過程[8]。已有研究表明，SOX9與PTEN信號通路的抑制有一定的關聯(lián)[9]。而有研究報道，PTEN/AKT通路在膀胱癌細胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。本研究證實，在膀胱癌EJ細胞中，沉默SOX9基因的表達可使PTEN蛋白表達增加，p-AKT蛋白表達降低。

綜上所述，沉默SOX9基因能夠明顯抑制膀胱癌EJ細胞株的增殖和遷移，并促進細胞凋亡，PTEN/AKT信號通路的激活可能與之有關。

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